|
|
The role of alternative splicing in plants
Földi, Marek ; Klodová, Božena (vedoucí práce) ; Fischer, Lukáš (oponent)
Alternativní sestřih představuje mechanismus regulace genové exprese, který udržuje, reguluje a vytváří genomovou diverzitu a pletivovou specificitu u rostlin. Zahrnuje odlišné spojování exonů v prekurzorových mRNA, což vede k více mRNA isoformám z jednoho genu. Vznik těchto isoformních variant a jejich následný překlad vede k subfunkcionalizaci proteinů a vytváří diverzitu ve struktuře a funkci. Alternativní sestřih je proto často důležitý v různých biologických procesech u rostlin, jako je vývoj, stresová odpověď, imunita a reprodukce. Klíčovými typy událostí alternativního sestřihu jsou retence intronů, vynechání exonů, alternativní 5'/3' sestřihová místa a vzájemně se vylučující exony. Regulace alternativního sestřihu zahrnuje cis-regulační elementy a trans-působící proteinové faktory, jako jsou serin/arginin bohaté (SR) proteiny a heterogenní jaderné ribonukleoproteiny (hnRNP). Tato práce shrnuje mechanismy a důsledky alternativního sestřihu ve vývoji rostlin, včetně zrání samčích a samičích gametofytů, meiózy a diferenciace buněk. Popisuje také metodologické přístupy, které umožňují studium alternativního sestřihu v celém genomu, včetně microarrays, RNA-seq a PCR. Lepší porozumění alternativnímu sestřihu poskytne pohledy do biologie rostlin a může usnadnit zemědělské a biotechnologické aplikace.
|
|
|
Fotosyntetické charakteristiky rostlin bramboru se sníženou expresí transkripčního faktoru BEL11
Dybová, Magdaléna ; Mašková, Petra (vedoucí práce) ; Fischer, Lukáš (oponent)
Lilek brambor (Solanum tuberosum) patří mezi nejdůležitější plodiny na světě. Hlízy se tvoří během morfogenního procesu zvaného tuberizace, jehož načasování je řízeno komplexní regulační sítí, do které zasahují podmínky prostředí i vnitřní faktory. Při studiu regulace tuberizace je nejčastěji využíván genotyp poddruhu S. t. andigena, který striktně vyžaduje krátkodenní fotoperiodu. Kulturní druhy S. t. tuberosum tuberizují i za podmínek dlouhé dne. Regulace iniciace tuberizace zahrnuje působení endogenních faktorů, zejména fytohormonů, sacharidů a mobilních signálů, mezi které patří mimo jiné BEL transkripční faktory - StBEL5, StBEL11 a StBEL29 -, které jsou produkovány listy a transportovány jako transkripty do stolonu. StBEL5 tuberizaci podporuje, StBEL11 a -29 ji naopak potlačují. Cílem této diplomové práce bylo přispět k objasnění role StBEL11 při regulaci tuberizace, a to pomocí charakterizace mutantů se sníženou expresí StBEL11. Dílčím cílem bylo odvození transgenní linie S. t. andigena se sníženou hladinou StBEL11 pomocí konstruktu s úsekem StBEL11 v antisense orientaci pod kontrolou 35S CaMV promotoru. Podařilo se odvodit 42 stabilních transgenních linií připravených ke stanovení hladiny StBEL11 mRNA. Dalším dílčím cílem bylo sledovat vliv snížení StBEL11 na fotosyntetické parametry,...
|
|
|
Metylace DNA řízená malými RNA u Arabidopsis thaliana
Motylová, Šárka ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Moravec, Tomáš (oponent)
Rozdílná transkripční aktivita různých oblastí genomu je zajišťována epigenetickými modifikacemi, mezi které patří metylace DNA, úprava N-koncových aminokyselin histonů a změny v zastoupení histonových variant. RNA interference je regulační proces, při kterém dochází prostřednictvím malých RNA odvozených z exogenních či endogenních sekvencí k posttrankripčnímu nebo transkripčnímu umlčení těchto sekvencí. 24-nukleotidové siRNA, tvořící část malých RNA, řídí de novo metylaci a spoluúčastní se udržování metylace DNA (RNA-directed DNA methylation; RdDM), která se podílí na transkripčním umlčení heterochromatinu a transponovatelných elementů, vyskytujících se u rostlin ve velkém množství. Pro krytosemenné je také charakteristická přítomnost RNA polymeráz IV a V účastnících se v této dráze, které byly poprvé objeveny v genomu Arabidopsis thaliana, jež se stala hlavní modelovou rostlinou i pro studium RdDM. Polymeráza IV přepisuje prekurzory siRNA; siRNA jsou následně asociované s AGO4 proteiny a navádějí metylační enzymy na cílové sekvence prostřednictvím komplementarity s transkripty polymerázy V.
|
|
|
RNA interference u rostlin
Čermák, Vojtěch ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Kulich, Ivan (oponent)
RNA interference je jedním z dějů, které umožňují v buňkách regulovat aktivitu genů. Tento proces je většinou spouštěn přítomností dvoušroubovicové RNA v buňce. Z takovéto RNA mohou být vyštěpovány duplexy malých RNA, většinou o délce 20-25 nukleotidů, za pomoci proteinu zvaného Dicer. Jednovláknové malé RNA uvolněné z těchto duplexů jsou základním kamenem RNA interference a lze je třídit do několika skupin na základě jejich biogeneze. U rostlin se setkáváme s miRNA a siRNA. Malé RNA asociují s proteinem zvaným Argonaut a navádějí jej na základě sekvenční komplementarity k cílové molekule. Argonaut může fungovat buďto sám nebo v komplexu s jinými proteiny. V závislosti na charakteru proteinů účastnících se tohoto děje spouští malé RNA různorodé procesy, které mohou vést ke štěpení mRNA (proces, na který stačí samotný komplex Argonaut a malá RNA), blokování translace nebo modifikacím chromatinu. S RNA interferencí se lze setkat u většiny Eukaryot, kde hraje roli ve vývoji organismů, jejich reakci na stres, úpravách chromatinu a také v obraně proti virům. U rostlin se setkáváme s rozmanitou škálou mechanismů, kterými může RNAi fungovat a kterým začínáme teprve postupně rozumět a doceňovat jejich význam.
|
|
|
Studium mechanismu posttranskripčního a transkripčního umlčování transgenů v buněčné linii tabáku BY-2
Čermák, Vojtěch ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Moravec, Tomáš (oponent)
RNA interference je jedním z mechanismů, který umožňuje buňkám regulovat aktivitu genů, ovlivňovat tvorbu a udržování heterochromatinu a chránit je před invazivními nukleovými kyselinami. U rostlin je RNA interference spouštěna přítomností dvoušroubovicové RNA, která je štěpena proteinem Dicer na malé RNA o délce převážně 20-24nt. Tyto malé RNA mohou v komplexu s proteinem Argonaut na základě sekvenční komplementarity řídit štěpení mRNA, blokování translace, či modifikace chromatinu. V důsledku tak může být genová exprese umlčována buď posttranskripčně (tím že je bráněno vzniku proteinu z již vytvořené mRNA, PTGS) a nebo transkripčně (tím že je bráněno vzniku transkriptu, TGS). Záměrem této práce bylo připravení různých způsobů spouštění posttranskripčního umlčování a porovnání jejich funkčnosti a účinnosti. Dalším krokem pak byla příprava systému, který by měl umožnit sledování jednotlivých kroků přechodu posttranskripčního umlčování na umlčování transkripční. Tyto tzv. indikátorové linie by měly dovolit sledovat časování a dynamiku tohoto procesu s využitím fluorescenčních proteinů. Připravovaný systém umožní také vyhodnocení různých faktorů na průběh tohoto procesu - jedním z nich je RNA-dependentní RNA polymeráza 6, která hraje hlavní roli v samovolném spouštění PTGS. V práci je použita jako modelový...
|
|
|
Transformace lilku bramboru genem kódujícím proteázový inhibitor SPI-2
Říhová, Barbora ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Vítámvás, Pavel (oponent)
Předmětem této diplomové práce byla genetická modifikace lilku bramboru za účelem zvýšení jeho rezistence vůči patogenům a škůdcům. Při vývoji rezistence rostlin se často využívá podobných typů molekul, které rostliny samy využívají při svých obranných reakcích. V této práci byl pro genetickou modifikaci použit gen kódující zástupce inhibitorů serinových proteáz SPI-2, pocházející ze zavíječe voskového (Galleria mellonella). Jelikož se v předchozích pokusech týmu protein SPI-2 nepodařilo v transformovaných rostlinách detekovat, byla základní forma genu upravena přidáním Kozakové sekvence do okolí iniciačního kodónu, čímž se měla zvýšit iniciace translace a tím hladina proteinu. Pro transformaci byly připraveny dva konstrukty, kódující proteiny SPI-2-T a SPI-2-Y, které se liší jednou aminokyselinou, a to mírně pozměňuje jejich inhibiční aktivitu. Konstrukt SPI-2-T byl nejprve pomocí infiltrace s Agrobacterium tumefaciens vnesen do listů tabáku Nicotiana benthamiana. Oba konstrukty SPI-2-T a SPI-2-Y byly poté použity pro stabilní transformaci lilku bramboru (Solanum tuberosum cv. Desireé). Přítomnost proteinu se však v rostlinách nepodařilo prokázat, přestože byl vnesený gen transkribován a jeho sekvence v rostlinách byla ověřena sekvenací. Je tedy pravděpodobné, že protein není v cytoplazmě...
|
|
|
Změna v rovnováze BELL transkripčních faktorů jako nástroj posílení tuberizace u vybraných kultivarů bramboru
Zounková, Andrea ; Mašková, Petra (vedoucí práce) ; Fischer, Lukáš (oponent)
Lilek brambor (Solanum tuberosum) je z hlediska lidské spotřeby třetí nejvýznamnější plodinou na světě. Pochopení regulačních mechanismů kontrolujících zakládání hlíz má tedy kromě teoretického i praktický význam. Tuberizace S. tuberosum je komplexní morfogenní proces regulovaný jak podmínkami prostředí, tak vnitřními poměry v rostlině. Environmentální podmínky regulující nástup tuberizace jsou již dlouho známy, nicméně molekulární podstata iniciace tvorby hlíz začala být odhalována teprve nedávno, a to zejména s využitím divokého poddruhu S. tuberosum subsp. andigena. Důležitou komponentou komplexní sítě regulačních drah kontrolujících nástup tuberizace jsou mj. BELL transkripční faktory. Cílem této práce je vychýlit rovnováhu mezi hladinami BELL transkripčních faktorů indukujících a reprimujících tuberizaci směrem k podpoření iniciace tvorby hlíz u vybraných odrůd kulturního poddruhu bramboru Solanum tuberosum subsp. tuberosum (kultivary Kamýk a Korela). Pro dosažení tohoto cíle byly odvozeny transgenní linie s vneseným konstruktem obsahujícím část kódujícího úseku StBEL11 resp. StBEL29 v antisense orientaci (AS) pod kontrolou konstitutivního promotoru a linie nesoucí konstrukt obsahující kompletní sekvence genů StBEL5+StPTB6 pod kontrolou nativních promotorů. Cílem vnesení prvních dvou konstruktů v...
|
|
|
Praktické využití geneticky modifikovaných rostlin
Říhová, Barbora ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Cvrčková, Fatima (oponent)
Genetické inženýrství (GI) rostlin je téma velice aktuální, a stále více kontroverzní, neboť se stává neodmyslitelnou součástí života nás všech. GI má, kromě jiného, velký potenciál pomoci vyřešit aktuální otázku hladu a podvýživy v určitých částech světa. Tato práce má za cíl objasnit, co jsou geneticky modifikované (GM) rostliny, představit možnosti praktického využití GM rostlin, způsoby přípravy a zvážit jejich výhody a případná rizika. GM rostlinou rozumíme rostlinu, které byla cíleně změněna genetická informace vnesením či vyjmutím části genetické informace (úseku DNA, zpravidla genu). Nejvíce používané metody transformace jsou transformace pomocí Agrobacteria tumefaciens a balistickou metodou. GM rostliny se mohou využívat pro produkci potravin a krmiv v lepší kvalitě a větší kvantitě, díky navozené vyšší odolnosti, ať už vůči stresu biotickému (vůči napadení škůdcem, virem, bakterií..), tak vůči abiotickému (sucho, salinita, toxické látky v půdě,..). Zejména odolnost vůči abiotickému stresu je aktuální problém, neboť díky měnícím se klimatickým podmínkám některé regiony stále více trpí nedostatkem srážek a následným suchem. Některé GM rostliny pěstované pro produkci potravin také mají lepší nutriční vlastnosti, což může pomoci vyřešit problém s nedostatkem určitých složek potravy v zemích třetího...
|
|
|
Na velikosti záleží - biogeneze a funkce siRNA u Arabidopsis
Přibylová, Adéla ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Honys, David (oponent)
RNA interference (RNAi) hraje důležitou roli v různých biologických procesech zahrnujících regulaci genů a transposonů, vývoje částí rostlinného těla, reakci na stres, remodelaci chromatinu a antivirovou obranu. Základem RNAi jsou krátké molekuly RNA (malé RNA, sRNA), které rostliny produkují ve velikostním rozmezí 21 - 24 nukleotidů (nt) a které jsou schopny na základě komplementarity rozpoznat cílové molekuly RNAi. Malé RNA lze rozdělit na dva základní typy: microRNA (miRNA) a malé interferující RNA (siRNA). K tvorbě a aktivitě malých RNA jsou potřeba proteiny z několika genových rodin: DICER-LIKE (DCL) vytváří malé RNA z dvouvláknového RNA prekurzoru, který je často tvořen aktivitou RNA dependentní RNA polymerázy (RDR). Proteiny ARGONAUTE (AGO) s těmito malými RNA asociují a vytváří tak RNA-indukovaný umlčující komplex (RISC), který hraje klíčovou roli v rozpoznání cílové molekuly a ve výkonné fázi RNAi. Na to, jakou dráhou se bude RISC komplex ubírat, má vliv velikost, struktura i biogeneze malé RNA. RNAi působí jednak na post-transkripční úrovni (PTGS), formou degradace cílové RNA či blokováním translace, a jednak na transkripční úrovni (TGS), kde sRNA zprostředkovávají metylaci histonů a DNA.
|
|
|
Revealing phosphoproteins playing role in tobacco pollen activated in vitro
Fíla, Jan ; Honys, David (vedoucí práce) ; Fischer, Lukáš (oponent)
6 Abstract in Czech Po dopadu na bliznu se zralý pyl tabáku rehydratuje, aktivuje a klíčí z něj pylová láčka. Rehydratace je doprovázena de-represí skladovaných mRNA, z nichž se syntetizují nové proteiny. Při vývoji zralého pylu v rychle rostoucí pylovou láčku se velmi pravděpodobně uplatňují také posttranslační modifikace proteinů, konkrétně fosforylace, jež se podílí na regulaci celé řady buněčných procesů. Vzhledem k tomu, že pouze malý podíl proteinů je v daném okamžiku v buňce fosforylován, bývá nevyhnutelné využít nejrůznější obohacovací techniky. Pro obohacení fosfoproteinů z celkového proteinového extraktu zralého pylu a pylu aktivovaného in vitro 30 minut byla v této diplomové práci aplikována afinitní chromatografie s využitím kovového oxidu/hydroxidu (MOAC), kde byl matricí hydroxid hlinitý. Získaná obohacená frakce byla rozdělena nezávisle dvěma metodami; klasickou dvojrozměrnou elektroforézou (2D-GE) a kapalinovou chromatografií (LC). Hmotnostní spektrometrií (MS) byly analyzovány vzorky získané oběma způsoby dělení, a celkem tak bylo identifikováno 139 fosfoproteinových kandidátů. Fosfopeptidové obohacení využívající oxid titaničitý vedlo k lokalizaci 51 fosforylačních míst, a tak rozšířilo počet přesně identifikovaných fosforylačních míst na celkových 52. Klíčová slova: samčí gametofyt, zralý...
|
host ::
RSS.