|
|
Incorporation of microbial cells in hydrogel carriers
Orišková, Sofia ; Pekař, Miloslav (oponent) ; Sedláček, Petr (vedoucí práce)
The presented diploma thesis focuses on the use of plant growth promoting bacteria as an ecological alternative to conventional fertilizers. The incorporation of bacterial cells into hydrogel carriers is already a well-studied topic, but due to its disadvantages it has not yet found wider application in agriculture. This work offers a novel concept of encapsulating bacteria by gelation directly from the culture. This is achieved by crosslinking the bacterial alginate produced by the model microorganism Azotobacter vinelandii. Since this process was not described before, first its optimization was needed. Alginate production was determined gravimetrically, and its parameters were further characterized using available analytical methods – infrared spectroscopy to monitor structural parameters (monomer composition and the extent of acetylation), dynamic light scattering to characterize the size distribution and AF4-MALS-dRI to obtain the molecular weight. Bacterial PHB production was also investigated using gas chromatography and infrared spectroscopy. The second part of the work is focused on the optimization of the gelling process using bacterial alginate from the culture and CaCl2 as a crosslinking agent. Rheological experiments were used as a tool in understanding the viscoelastic properties of the prepared gels. Gelation was demonstrated within the first day after inoculation. Maximum production of alginate (1,9 ± 0,3) g/l was reached on the fourth day after inoculation. It was found that the addition of 5 g/l of calcium carbonate promotes the production of alginate. Nevertheless, further addition of CaCO3 (30 g/l) showed adverse effects on the molecular weight and is therefore not recommended. Production of PHB was confirmed by both FTIR and GC measurements, with a maximum yield of (23 ± 3) % CDW. Rheological testing confirmed that the product of the crosslinking was a gel. It was found that the crosslinker concentration plays an important role at time 0 min of the gelation, forming a denser network in the structure and causing higher rigidity. Using the highest studied concentration of CaCl2, the critical strain reached values of (5,0 ± 0,7) %. Finally, the incorporation of bacterial cells into the hydrogel was confirmed using fluorescence microscope.
|
|
|
Hydrogelové nosiče mikroorganismů v moderních environmentálních aplikacích
Súkeník, Martin ; Slaninová, Eva (oponent) ; Sedláček, Petr (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce se zabývá optimalizací kultivace a gelace bakterie rodu Azotobacter vinelandii patřící do skupiny PGPR, která je schopná syntetizovat intracelulární polyhydroxyalkanoáty a extracelulární alginát. Bakterií produkovaný alginát je síťován pomocí roztoku chloridu vápenatého za vzniku hydrogelového nosiče obsahující zmíněnou bakterii. Tento nekonvenční koncept enkapsulace bakterií přináší zjednodušení procesu výroby hydrogelových nosičů a širší uplatnění v moderních environmentálních aplikacích. V první části práce byly vybrány tři kmeny (DSM 85, 87 a 720), při kterých byla gravimetricky stanovena koncentrace produkovaného alginátu, jeho molekulová hmotnost byla určena technikou SEC-MALS a poměr M/G podjednotek byl analyzován technikou infračervené spektroskopie. Kmen Azotobacter vinelandii DSM 87 dosáhl při gravimetrickém stanovení nejvyšší koncentraci alginátu (4,9 ± 0,6) g/l v 5. den kultivace. Koncentrace produkovaného PHB se pohybovala v rozmezí 6 až 48 % CDW, která byla určena metodou plynové chromatografie. Nicméně nejlepší gelační vlastnosti vykazoval kmen DSM 720, který byl v druhé části práce použit na podrobnější optimalizaci kultivačních podmínek, a dále na analýzu tvorby gelů při rozdílné teplotě, čase gelovatění a různé koncentraci síťovacího činidla. Vytvořené gely byly porovnané reologickým měřením pomocí amplitudového a frekvenčního testu.
|
|
|
Self-encapsulation of Plant Growth Promoting Rhizobacteria as a way towards new generation of bioinoculants
Gašparová, Dominika ; Obruča, Stanislav (oponent) ; Sedláček, Petr (vedoucí práce)
This bachelor thesis focuses on Plant Growth-Promoting Rhizobacteria that can be used as a suitable ecological alternative to conventional fertilizers. However, most of today's approaches to incorporating PGPR into the process of soil fertilization are convoluted and costly. Crosslinking of alginate self-produced by PGPR offers a new possibility of plantgrowth- promoting bacteria encapsulation. The aim of this thesis consists of preparing gel matrices with incorporated bacteria, followed by testing the bacteria's viability and quantity. Firstly, experiments were carried out to determine various properties of gels produced by the chosen representative bacteria Azotobacter vinelandii. These properties include the molecular weight of alginate (with the highest molecular weight of strain CCM 289 (329,78± 6,8) kDa), the alginate's amount in the gel, the content of PHB (34%-44% CDW), and the gel's overall rheological properties. The complex modulus (as a representation of rheological properties) of the firmest gel reached the value of 13,34 kPa. The bacteria content was examined by flow cytometry, the CFU method, and spectrophotometry. The viability of bacteria was determined by analyzing the fluorescence intensity via fluorescent dyes (propidium iodide, fluorescein diacetate, rhodamine 123, calcein AM), then by using the CFU method, and also via the plate method. Furthermore, the effects of various factors such as different pH levels (pH 3, 7, and 10) or adding the specific alginatedegrading enzyme alginase were also examined. Releasing of the bacteria was observed over the course of seven days using flow cytometry and the CFU method. The plate method proved the bacteria's survival after gelation and without any source of carbon. The largest disintegration of gels occurred in acidic pH. Moreover, the effect of alginase on crosslinked bacterial gels and synthetic alginate were very similar. The survival of bacterial cultures in gel and their continuous release are significant findings in the development of novel bioinoculants based on this new concept.
|
|
|
Study of polyhydroxybutyrate production in bacteria
Melušová, Soňa ; Babák, Libor (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
Presented work is focused on study of polyhydroxybutyrate production in bacteria. In theoretical part short characterization of PHB was given and the most common representative of wide group of polyhydroxyalkanoates (PHA) were described. Then, production of PHB and copolymer P(HB-co-HV) in selected bacterial strains was experimentally proven. First, PHB production in Bacillus megaterium using synthetic medium was studied. The PHB content in cells was increased during cultivation under limiting conditions, despite low growth. Addition of ethanol into production media resulted in increased PHB synthesis as well as biomass production (21 % PHB of 1,8 g/l biomass). Further, BM medium containing 8 g/l glucose was tested. PHB production was more than 1 g/l at significant growth increase when compared with synthetic medium. The bacteria B.megaterium showed, except glucose, ability to utilize maltose and xylose. Another cultivations were tested with bacterial strain Azotobacter vinelandii, which is capable of copolymer P(HB-co-HV) synthesis. Maximal growth and copolymer content was reached on Burk's medium with 30 g/l of glucose. Addition of peroxide to growth medium influenced P(HB-co-HV) synthesis to 46 % of 2,6 g/l biomass. Bacteria A.vinelandii showed the best growth on maltose, even compared with glucose (54 % copolymer of biomass content). Finally, PHB production on industrial waste product – whey was monitored. Using Plackett-Burman design for statistical media optimization, the whey content was modified. B.megaterium grown on adjusted whey reached 0,5 g/l PHB, 32 % of cell's content.
|
|
|
Využití optických a mikrofluidních technik k analýze a separaci mikrobiálních buněk
Večeríková, Paula ; Bernatová,, Silvie (oponent) ; Samek,, Ota (vedoucí práce)
Predkladaná diplomová práca sa zaoberá predovšetkým Ramanovou spektroskopiou a jej prepojeniami s mikrofluidnými technikami spolu s potenciálne biotechnologicky zaujímavými produktmi bakteriálnych kmeňov Janthinobacterium lividum a Azotobacter vinelandii. Metódy použité v tejto práci boli zvolené pre ich nedeštruktívnu povahu, ktorá umožňuje rýchlu analýzu buniek a ich porovnanie s plynovou chromatografiou. Po analýze je možné bunky ďalej kultivovať, prípadne pripraviť generáciu s nadmernou produkciou vybraného metabolitu. Janthinobacterium lividum je bakteriálny kmeň produkujúci pigment - violaceín, ktorý má značný biotechnologický potenciál ako liečivo, antioxidant, fluorescenčná sonda či farbivo. Schopnosť rozlíšiť bunky produkujúce a neprodukujúce violaceín môže mať preto široké uplatnenie v diagnostike a identifikácii. V experimentálnej časti boli zmerané spektrá troch kmeňov, na základe ktorých bol vybraný zástupca Janthinobacterium lividum CCM 160, ktorý bol analyzovaný využitím Ramanovskej pinzety spolu s Cupriavidus necator H16. Vyhodnotením pomocou analýzy hlavných komponentov bola zistená rozlíšiteľnosť pigmentovaných kultúr od nepigmentovaných a bol vybraný potenciálny triediaci marker 1 140 cm-1 (príslušný pre violaceín) pre ďalšie merania. Biotechnologický potenciál kmeňa Azotobacter vinelandii spočíva v schopnosti fixovať dusík z atmosféry, produkovať alginát a polyhydroxybutyrát. Experimentálna časť práce sa zameriava na identifikáciu Ramanových spektier piatich kmeňov a alginátov extrahovaných z nich. Polyhydroxybutyrát (PHB) je biologicky odbúrateľný polymér nahrádzajúci petrochemické plasty. Pre výrobu PHB je Azotobacter vinelandii adeptom pre komerčnú výrobu, ktorý ako jeden z mála vyrába PHB priamo zo vzdušného dusíka, čo môže viesť k zníženiu výrobnej ceny a tým aj vyššiemu zastúpenia rozložiteľných plastov na trhu. Najvyššia odpoveď pre PHB v Ramanových spektrách bola nameraná u Azotobacter vinelandii DSM 720 a naopak najnižšia u Azotobacter vinelandii DSM 85. Kvantitatívne informácie pre porovnanie boli získané z plynovej chromatografie, ktoré potvrdili merania z Ramanovej spektroskopie. Vyhodnotením nameraných Ramanových spektier čistých alginátov je možné predpokladať, že sa jedná o heteropolymérne frakcie, keďže v spektrách bol detegovaný prejav rôznych monomérov. V závislosti od zloženia podjednotiek sa menia vlastnosti alginátu, preto je potrebné poznať zloženie pre jeho úpravu pre ďalšie využitie v medicíne alebo potravinárstve. Z piatich kmeňov Azotobacter vinelandii boli vybraní producenti s najvyšším a najnižším obsahom PHB, ktorí boli následne analyzovaní pomocou Ramanovej pinzety. Vyhodnotením pomocou analýzy hlavných komponentov bola zistená rozlíšiteľnosť týchto kmeňov a možnosť ich následného oddelenia využitím triediaceho parametra (1 060 cm-1).
|
|
|
Vývoj nové generace bioinokulantů a studium jejich biologické aktivity
Súkeník, Martin ; Pekař, Miloslav (oponent) ; Sedláček, Petr (vedoucí práce)
Cíl této diplomové práce spočíval v charakterizaci specifických mechanismů biologické aktivity u bakterií podporujících růst rostlin (PGPR), běžně se nacházející v rhizosféře rostlin a ve studii účinků aplikace kapalných i gelových PGPR bioinokulantů na rostliny v kontrolovaném prostředí. Pro přípravu gelových bioinokulantů na bázi těchto PGPR byl navržen originální koncept samo-enkapsulace prostřednictvím síťování alginátu přímo produkovaného v průběhu jejich biotechnologické kultivace. Ověření účinnosti tohoto konceptu vyžadovalo všechny vybrané kmeny podrobit gelačním experimentům se síťovacím činidlem CaCl2 2 % hm. za tvorby alginátového gelu. Pro přípravu a charakterizaci bioinokulantů byly vybrány tři konkrétní kmeny Azotobacter vinelandii DSM 87, DSM 720 a CCM 289. Materiálové vlastnosti vytvořených gelů byly charakterizovány metodou oscilační reometrie (amplitudovým testem). Všechny kmeny byly podrobeny gravimetrickému stanovení koncentrace alginátu i biomasy. Pro ověření viability buněk ihned po kultivaci byla použita průtoková cytometrie s fluorescenční sondou PI, DAPI a SYTOX™ Green. Dále bylo provedeno sušení gelů s pomocí lyofilizátoru, kdy lyofilizovaný gel byl použit při botnacích experimentech s následným sušením. V rámci ověření biologické aktivity bioinokulantů byla kvalitativně ověřena schopnost všech kmenů rozpouštět a utilizovat fosfáty z agarového živného média. Dále byla u všech kmenů spektrofotometricky ověřena produkce indol-3-octové kyseliny. Kvalitativně i kvantitativně byla ověřena také produkce sideroforů. Pěstební pilotní experimenty na rostlině lociky salátové (Lactuca sativa) byly provedeny s přídavkem kapalné i gelové nosičové PGPR kompozice, jako negativní kontrola byla rostlina ponechána bez přídavku nosičové PGPR kompozice. Výsledky z pilotního pěstebního experimentu prokázaly pozitivní růstový efekt gelové i kapalné PGPR kompozice na rostliny. Na konci pěstebního experimentu byla zaznamenána vyšší délka listů a kořenového systému po aplikaci obou forem PGPR do půdy, konkrétně průměrná délka listů s přídavkem gelové nosičové PGPR kompozice byla 4,3±1,0 cm, pro kapalnou nosičovou PGPR kompozici 4,3±1,2 cm, průměrná délka kořenového systému byla 18,3±5,2 cm respektive 17,4±6,0 cm. Hmotnost sušiny na jednu vypěstovanou rostlinu s přídavkem kapalné i gelové PGPR byla shodná, tedy 0,19±0,07 g. Nejvyšší obsah chlorofylu a, chlorofylu b i karotenoidů v listech byl spektrofotometricky prokázán u rostlin rostoucích s přídavkem kapalné PGPR kompozice, konkrétně chlorofylu a bylo zjištěno 6±1 µg/ml, chlorofylu b 7±2 µg/ml a karotenoidů 3,6±0,5 µg/ml. Pomocí destiček BIOLOG EcoPlate™ byla analyzována diverzita půdních mikrobiomů odebraných z půdy bez přídavku PGPR kompozice, s přídavkem kapalné PGPR kompozice a s přídavkem gelové PGPR kompozice. Diverzita mikrobiomu byla vyhodnocena pomocí průměrného vývoje barvy jamky, tedy parametru AWCD a pomocí Shannonova indexu diverzity H'. Nejvyšší utilizace nejširšího počtu uhlíkových zdrojů na destičce byla zaznamenána u půdního mikrobiomu s přídavkem gelové PGPR kompozice. Již zmíněný půdní mikrobiom také vykazoval nejvyšší hodnotu indexu H'.
|
|
|
Využití různých gelačních strategií při vývoji nové generace bioinokulantů
Krýslová, Jana ; Smilek, Jiří (oponent) ; Sedláček, Petr (vedoucí práce)
Tato diplomová práce se zabývá nad různými přístupy síťování bakteriálních kultur kmene Azotobacter vinelandii, která patří do skupiny PGPR a je schopná produkovat extracelulárně alginát. Cílem tohoto síťování je produkce nové generace bioinokulantů založených na tomto bakteriálním druhu. První část je věnována zkoumání vlivu kyslíku v rámci kultivace na samotnou gelaci bakteriálních kultur. Experimentálně bylo zjištěné, že bakteriální kultury v celkovém objemu 50 a 100 ml v 250 ml Erlenmayerových baňkách vykazovaly gelaci už v samotné médiu, přičemž vzniklé gely byly měřené reometricky a vykazovaly hodnoty komplexního modulu 0,026 kPa a 0,030 kPa. Při bakteriální kultuře v celkovém objemu 150 ml nedošlo k spontánnímu síťování v průběhu gelace. Kromě testování gelace byl v bakteriálních kulturách stanovený i obsah PHB a extracelulárního alginátu a jeho molekulová hmotnost metodou velikostně vylučovací chromatografie s víceúhlovým rozptylem světla (SEC-MALS) a pevnost vzniklých gelů pomocí reometrie. Síťování bakteriálních kultur probíhalo především s využitím CaCl2 jako síťovacího činidla, avšak byly otestované i alternativní způsoby gelace (prostřednictvím vícemocných iontů, slabých organických kyselin, srážedel jako DMSO, emulzní gelace). Taktéž byl otestovaný vliv glukono-D-laktonu (GDL) jako činidla indukujícího gelaci postupným uvolňováním síťovacích iontů v médiu z nerozpustné formy. Nejpevnější gely vznikaly přídavkem vícemocných iontů (pohybovaly se v hodnotě komplexního modulu 10 kPa, v případě použití slabých kyselin a DMSO se gely pohybovaly v hodnotě komplexních modulů v rozmezí 1 až 10 kPa. Přídavek GDL nevytvářel gely okamžitě, ale opožděně a došlo ke sledování gelovatění v čase. Vytvořený gel se pohyboval v hodnotě do 1 kPa.
|
|
|
Self-encapsulation of Plant Growth Promoting Rhizobacteria as a way towards new generation of bioinoculants
Gašparová, Dominika ; Obruča, Stanislav (oponent) ; Sedláček, Petr (vedoucí práce)
This bachelor thesis focuses on Plant Growth-Promoting Rhizobacteria that can be used as a suitable ecological alternative to conventional fertilizers. However, most of today's approaches to incorporating PGPR into the process of soil fertilization are convoluted and costly. Crosslinking of alginate self-produced by PGPR offers a new possibility of plantgrowth- promoting bacteria encapsulation. The aim of this thesis consists of preparing gel matrices with incorporated bacteria, followed by testing the bacteria's viability and quantity. Firstly, experiments were carried out to determine various properties of gels produced by the chosen representative bacteria Azotobacter vinelandii. These properties include the molecular weight of alginate (with the highest molecular weight of strain CCM 289 (329,78± 6,8) kDa), the alginate's amount in the gel, the content of PHB (34%-44% CDW), and the gel's overall rheological properties. The complex modulus (as a representation of rheological properties) of the firmest gel reached the value of 13,34 kPa. The bacteria content was examined by flow cytometry, the CFU method, and spectrophotometry. The viability of bacteria was determined by analyzing the fluorescence intensity via fluorescent dyes (propidium iodide, fluorescein diacetate, rhodamine 123, calcein AM), then by using the CFU method, and also via the plate method. Furthermore, the effects of various factors such as different pH levels (pH 3, 7, and 10) or adding the specific alginatedegrading enzyme alginase were also examined. Releasing of the bacteria was observed over the course of seven days using flow cytometry and the CFU method. The plate method proved the bacteria's survival after gelation and without any source of carbon. The largest disintegration of gels occurred in acidic pH. Moreover, the effect of alginase on crosslinked bacterial gels and synthetic alginate were very similar. The survival of bacterial cultures in gel and their continuous release are significant findings in the development of novel bioinoculants based on this new concept.
|
|
|
Hydrogelové nosiče mikroorganismů v moderních environmentálních aplikacích
Súkeník, Martin ; Slaninová, Eva (oponent) ; Sedláček, Petr (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce se zabývá optimalizací kultivace a gelace bakterie rodu Azotobacter vinelandii patřící do skupiny PGPR, která je schopná syntetizovat intracelulární polyhydroxyalkanoáty a extracelulární alginát. Bakterií produkovaný alginát je síťován pomocí roztoku chloridu vápenatého za vzniku hydrogelového nosiče obsahující zmíněnou bakterii. Tento nekonvenční koncept enkapsulace bakterií přináší zjednodušení procesu výroby hydrogelových nosičů a širší uplatnění v moderních environmentálních aplikacích. V první části práce byly vybrány tři kmeny (DSM 85, 87 a 720), při kterých byla gravimetricky stanovena koncentrace produkovaného alginátu, jeho molekulová hmotnost byla určena technikou SEC-MALS a poměr M/G podjednotek byl analyzován technikou infračervené spektroskopie. Kmen Azotobacter vinelandii DSM 87 dosáhl při gravimetrickém stanovení nejvyšší koncentraci alginátu (4,9 ± 0,6) g/l v 5. den kultivace. Koncentrace produkovaného PHB se pohybovala v rozmezí 6 až 48 % CDW, která byla určena metodou plynové chromatografie. Nicméně nejlepší gelační vlastnosti vykazoval kmen DSM 720, který byl v druhé části práce použit na podrobnější optimalizaci kultivačních podmínek, a dále na analýzu tvorby gelů při rozdílné teplotě, čase gelovatění a různé koncentraci síťovacího činidla. Vytvořené gely byly porovnané reologickým měřením pomocí amplitudového a frekvenčního testu.
|
|
|
Incorporation of microbial cells in hydrogel carriers
Orišková, Sofia ; Pekař, Miloslav (oponent) ; Sedláček, Petr (vedoucí práce)
The presented diploma thesis focuses on the use of plant growth promoting bacteria as an ecological alternative to conventional fertilizers. The incorporation of bacterial cells into hydrogel carriers is already a well-studied topic, but due to its disadvantages it has not yet found wider application in agriculture. This work offers a novel concept of encapsulating bacteria by gelation directly from the culture. This is achieved by crosslinking the bacterial alginate produced by the model microorganism Azotobacter vinelandii. Since this process was not described before, first its optimization was needed. Alginate production was determined gravimetrically, and its parameters were further characterized using available analytical methods – infrared spectroscopy to monitor structural parameters (monomer composition and the extent of acetylation), dynamic light scattering to characterize the size distribution and AF4-MALS-dRI to obtain the molecular weight. Bacterial PHB production was also investigated using gas chromatography and infrared spectroscopy. The second part of the work is focused on the optimization of the gelling process using bacterial alginate from the culture and CaCl2 as a crosslinking agent. Rheological experiments were used as a tool in understanding the viscoelastic properties of the prepared gels. Gelation was demonstrated within the first day after inoculation. Maximum production of alginate (1,9 ± 0,3) g/l was reached on the fourth day after inoculation. It was found that the addition of 5 g/l of calcium carbonate promotes the production of alginate. Nevertheless, further addition of CaCO3 (30 g/l) showed adverse effects on the molecular weight and is therefore not recommended. Production of PHB was confirmed by both FTIR and GC measurements, with a maximum yield of (23 ± 3) % CDW. Rheological testing confirmed that the product of the crosslinking was a gel. It was found that the crosslinker concentration plays an important role at time 0 min of the gelation, forming a denser network in the structure and causing higher rigidity. Using the highest studied concentration of CaCl2, the critical strain reached values of (5,0 ± 0,7) %. Finally, the incorporation of bacterial cells into the hydrogel was confirmed using fluorescence microscope.
|
host ::
RSS.