|
|
Studium funkce fosfoglukozaminmutázy GlmM u Streptococcus pneumoniae
Mühldorfová, Tereza ; Ulrych, Aleš (vedoucí práce) ; Lišková, Petra (oponent)
Fosfoglukozaminmutáza (GlmM), je enzym biosyntézy buněčné stěny, u kterého byla nedávno prokázána jeho esencialita u Streptococcus pneumoniae. Hlavním cílem této diplomové práce bylo definitivně dokázat esencialitu fosforylace serinových zbytků S99 a S101 enzymu GlmM v podmínkách in vivo, jejíž nezbytnost byla již dříve prokázána nepřímo na základě transformační účinnosti. Pro tento účel jsme vytvořili kmen, který obsahuje dvě kopie genu glmM - jednu s aminokyselinovými záměnami na sledovaných serinových zbytcích umístěnou v nativním lokusu a druhou ektopickou kopii divoké formy genu glmM pod kontrolou inducibilního zinkového promotoru. U tohoto kmene jsme sledovali morfologii, růst i expresi GlmM v prostředí s induktorem i bez něho. Ve všech sledovaných parametrech bylo zřejmé, že bez přidání induktoru ektopické exprese genu glmM nejsou buňky životaschopné, a tedy že esenciální protein GlmM je funkční pouze ve fosforylované formě na S99 a S101. Dále jsme se pokusili lokalizovat tento enzym v buňce S. pneumoniae. GlmM jsme fúzovali s fluorescenční značkou GFP a pomocí fluorescenční mikroskopie jsme prokázali, že se jedná o cytoplazmatický protein. Dalším cílem této práce bylo stanovit třetí neznámé místo fosforylace proteinu GlmM in vitro závislé na proteinkináze StkP. Z kinázové reakce in vitro a následné...
|
|
|
Životní strategie fakultativně vnitrobuněčných patogenních bakterií
Fejková, Kateřina ; Lišková, Petra (vedoucí práce) ; Mašín, Jiří (oponent)
Fakultativní vnitrobuněčné patogeny si vyvinuly schopnost růst a přežít mimo i uvnitř buňky, což jim dává selektivní výhodu, lepší přístup k živinám, ochranu před extracelulárními složkami imunitního systému a nestálými podmínkami mimo buňku. Bakterie Francisella tularensis a Listeria monocytogenes se umí ubránit prvotním obranným reakcím imunitního systému, vstoupit dovnitř makrofágů i neprofesionálních fagocytů jako jsou například hepatocyty či endotel, předejít baktericidním procesům ve fagosomu, rozmnožit se v cytosolu a poté vzdorovat procesům buněčné smrti dokud samy nejsou připraveny infikovanou buňku opustit a napadnout další buňky. Toto přemístění mezi buňkami používá Listeria monocytogenes G-aktin hostitelské buňky, zatímco u bakterie Francisella tularensis není mechanismus zcela jasný. Popis mechanismu těchto procesů u patogenů Francisella tularensis a Listeria monocytogenes je předmětem této bakalářské práce. Klíčová slova: bakteriální patogen, fakultativní, vnitrobuněčný, Francisella tularensis, Listeria monocytogenes
|
|
|
Prospektivní studie dlouhodobých zrakových následků akutních intoxikací metanolem
Nurieva, Olga ; Zacharov, Sergej (vedoucí práce) ; Lišková, Petra (oponent) ; Pohanka, Miroslav (oponent)
Kontext: Otrava metanolem je život ohrožující stav, který způsobuje toxickou neuropatii zrakového nervu s možnými dlouhodobými zrakovými následky u osob přeživších otravu. Cíl: Zjistit prevalenci, charakter, dynamiku a klíčové determinanty chronických morfologických a funkčních změn zrakového systému v průběhu 4 let po akutní optické neuropatii způsobené intoxikací metanolem. Materiál a metodika: Celkem 55 pacientů s potvrzenou diagnózou otravy metanolem ve věku 46.7 ± 3.6 let (46 mužů a 9 žen) a 41 kontrol bylo vyšetřeno v rámci prospektivní longitudinální kohortové studie. Pacienti byli vyšetřeni 4.9 ± 0.6, 25.0 ± 0.6 a 49.9 ± 0.5 měsíců po propuštění z nemocnice. Protokol klinického vyšetření zahrnoval měření zrakových evokovaných potenciálů (VEP), optickou koherenční tomografii tloušťky vrstvy nervových vláken sítnice (RNFL), magnetické rezonanční vyšetření mozku (MRI), kompletní oftalmologické vyšetření, biochemická vyšetření a určení genotypu apolipoproteinu E (ApoE). Výsledky: Ze 42/55 pacientů, kteří absolvovali všechna tři kola vyšetření, byla abnormální tloušťka RNFL zjištěna u 13 (31%) a progredující pokles tloušťky RNFL byl v době sledování pozorován u 10 (24%) pacientů. Riziko chronického poklesu globální RNFL pro pH arteriální krve <7.3 při příjmu bylo 11.65 (1.91-71.12; 95% CI) po adjustaci...
|
|
|
Bakteriální RTX proteiny a jejich vazebná místa pro vápník.
Lišková, Petra
Protein FrpC je produkovaný bakterií Neisseria meningitidis v lidském hostiteli. Tento protein je charakteristický přítomností RTX domény, která jej řadí do stejnojmenné rodiny bakteriálních toxinů. Protein FrpC vykazuje unikátní autokatalytickou štěpící aktivitu, kterou zajišťuje 177 aminokyselin dlouhá část (SPM, Self-Processing Module). Bez navázaného Ca2+ zaujímá SPM neuspořádanou strukturu. Po vazbě iontu se protein sbalí a je schopen vykonat enzymatickou aktivitu. Analýza struktury sbaleného SPM by mohla odhalit funkční souvislosti vazby iontu a autokatalytického sestřihu. Bohužel řešení struktury SPM pomocí NMR se ukázalo být velmi obtížné kvůli dlouhé nestrukturované části sekvence uvnitř SPM. Předmětem této práce se tedy stal popis SPM pomocí fluorescenčních metod, charakterizace vazby iontu do SPM, tak i strukturních změn, které se v průběhu vazby Ca2+ odehrávají. Byla stanovena disociační konstanta vazby kovového iontu do SPM, kD~17 µM, která se nachází v koncentračním rozmezí Ca2+, kdy dochází ke sbalování SPM proteinu (1-20 µM). Součástí pochopení struktury SPM bylo zjištění, že obě tryptofanová rezidua Trp451 a Trp519 v SPM interagují jak s navázanými ionty, tak spolu navzájem. Pro tento účel byly použity plně funkční varianty SPM s jedním tryptofanem, W451F a W519F, a luminiscenční...
|
|
|
Antibakteriální a antiadhezivní účinky uhlíkových nanomateriálů
Budil, Jakub ; Lišková, Petra (vedoucí práce) ; Zikánová, Blanka (oponent)
Rostoucí zájem o průmyslové a klinické využití uhlíkových nanomateriálů vyvolává potřebu výzkumu jejich interakce s živými systémy. Vrstvy nanokrystalického diamantu (NCD) jsou mechanicky a chemicky odolné a biokompatibilní s lidskými buňkami, proto lze uvažovat o jejich použití v lidském těle. Některé uhlíkové nanočástice mohou vykazovat výrazné antibakteriální účinky. V této práci jsou používány NCD s vodíkovou, kyslíkovou a fluorovou terminací nanesené na sklo a křemík a je zkoumán jejich vliv na adhezi gramnegativní bakterie Escherichia coli K-12 v minerálním médiu, pro který byl optimalizován protokol kultivace biofilmu. Narostlý biofilm je kvantifikován pomocí metody barvení krystalovou violetí optimalizované v rámci této práce. V práci je dále porovnáván vliv kultivačního média na (antiadhezivní) účinky NCD. Bylo zjištěno, že vlastnosti vrstev NCD nezávisí na podložním substrátu. Vrstvy NCD terminované vodíkem a fluorem vykazují antiadhezivní charakter pouze v minerálním médiu, ale ne v komplexním médiu, což je zdůvodněno tvorbou kondiční vrstvy v komplexním médiu. Kyslíkem terminované vrstvy NCD naopak podporují bakteriální adhezi za obou podmínek. V druhé části této práce jsou testovány účinky uhlíkových nanočástic s antibakteriálním potenciálem, konkrétně nanodiamantu, uhlíkových...
|
|
|
Bakteriální RTX proteiny a jejich vazebná místa pro vápník.
Lišková, Petra ; Konopásek, Ivo (vedoucí práce) ; Holoubek, Aleš (oponent) ; Hof, Martin (oponent)
Protein FrpC je produkovaný bakterií Neisseria meningitidis v lidském hostiteli. Tento protein je charakteristický přítomností RTX domény, která jej řadí do stejnojmenné rodiny bakteriálních toxinů. Protein FrpC vykazuje unikátní autokatalytickou štěpící aktivitu, kterou zajišťuje 177 aminokyselin dlouhá část (SPM, Self-Processing Module). Bez navázaného Ca2+ zaujímá SPM neuspořádanou strukturu. Po vazbě iontu se protein sbalí a je schopen vykonat enzymatickou aktivitu. Analýza struktury sbaleného SPM by mohla odhalit funkční souvislosti vazby iontu a autokatalytického sestřihu. Bohužel řešení struktury SPM pomocí NMR se ukázalo být velmi obtížné kvůli dlouhé nestrukturované části sekvence uvnitř SPM. Předmětem této práce se tedy stal popis SPM pomocí fluorescenčních metod, charakterizace vazby iontu do SPM, tak i strukturních změn, které se v průběhu vazby Ca2+ odehrávají. Byla stanovena disociační konstanta vazby kovového iontu do SPM, kD~17 µM, která se nachází v koncentračním rozmezí Ca2+, kdy dochází ke sbalování SPM proteinu (1-20 µM). Součástí pochopení struktury SPM bylo zjištění, že obě tryptofanová rezidua Trp451 a Trp519 v SPM interagují jak s navázanými ionty, tak spolu navzájem. Pro tento účel byly použity plně funkční varianty SPM s jedním tryptofanem, W451F a W519F, a luminiscenční...
|
|
|
Vznik a genetická podstata glykopeptidové rezistence u koaguláza-negativních stafylokoků
Prášilová, Jana ; Balíková Novotná, Gabriela (vedoucí práce) ; Lišková, Petra (oponent)
Glykopeptidová antibiotika jsou tzv. antibiotika poslední volby, v klinické praxi využívaná k léčbě těžších, převážně nozokomiálních infekcí vyvolaných multirezistentními koaguláza-negativními stafylokoky. Vznik a genetická podstata rezistence ke glykopeptidovým antibiotikům nebyla u koaguláza-negativních stafylokoků doposud objasněna. Výzkumy prováděné u Staphylococcus aureus prokázaly, že střední rezistence ke glykopeptidovým antibiotikům je spojena s přítomností jedné či více mutací, spíše než by byla podmíněna nosičstvím konkrétního genetického elementu, jako je tomu u enterokoků. Různými druhy selekce rezistentních mutant in vitro byly získávány izogenní páry glykopeptid citlivých a rezistentních kmenů Staphylococcus epidermidis a Staphylococcus haemolyticus. Analýzou sekvencí genomů těchto dvojic byly následně identifikovány jedno nukleotidové polymorfismy, které se nacházely převážně v systémech řídících metabolismus a regulaci buněčné stěny. Fenotypová analýza neodhalila přímé spojení glykopeptidové rezistence se zvýšenou tvorbou biofilmu. V klinické praxi je problematický vznik zkřížené rezistence glykopeptidových a jiných antibiotik. U neglykopeptidových antibiotik imipenemu a rifampicinu byl již dříve popsán výskyt zkřížené rezistence s glykopeptidovými antibiotiky u S. aureus. Selekcí...
|
|
|
The role of PIP5K family kinases in plasma membrane remodeling
Apolínová, Kateřina ; Macůrková, Marie (vedoucí práce) ; Lišková, Petra (oponent)
Fosfatidylinositol 4-fosfát 5-kináza (PIP5K) je enzym, který je zodpovědný za tvorbu fosfatidylinositol 4,5-bisfosfátu (PI(4,5)P2). Je již dlouho známo, že PI(4,5)P2 slouží jako prekurzor dvou velmi důležitých druhých poslů, diacylglycerolu a inositol trisfosfátu. PI(4,5)P2 ovšem také sám funguje jako druhý posel a reguluje mnoho procesů probíhajících na plasmatické membráně, jako například endo- a exocytózu, remodelaci aktinového cytoskeletu a tvorbu mezibuněčných spojů. Aktivita PIP5K musí být v buňce pečlivě časově i prostorově regulována, aby mohlo dojít k lokální tvorbě membránových mikrodomén bohatých na PI(4,5)P2. Tyto mikrodomény jsou zásadní pro regulaci mnoha různých buněčných dějů, kterých se PIP5K účastní. Tato bakalářská práce se zaměřuje na popis regulačních mechanismů, které ovlivňují aktivitu PIP5K in vivo, a na fyziologické funkce PIP5K na plasmatické membráně.
|
|
|
Význam velikosti a geometrie nanočástic na jejich internalizaci buňkou
Číhařová, Barbora ; Španielová, Hana (vedoucí práce) ; Lišková, Petra (oponent)
Nanočástice mohou být v biomedicínských oborech využívány jako nosiče pro dopravu diagnostických a terapeutických látek do buněk. Experimentálně se využívají nanočástice různých tvarů, velikostí a různého složení. Navzdory objevům, kterých bylo již v této oblasti dosaženo, přesná povaha interakcí nanočástic s buňkou zatím není zcela pochopena. Cílem práce je poskytnout poznatky o možnostech využití a aspektech ovlivňujících interakci s buněčnou membránou u několika typů modelových nanočástic: u liposomů, u zlatých nanočástic a u viru podobných nanočástic. Ze srovnání vyplývá, že zobecnění buněčného vstupu pro různé typy nanočástic je problematické, ač se zdá, že obecně efektivnější vstup vykazují kulaté nanočástice s průměrem 50 nm.
|
|
|
Molekulárně genetické příčiny vývojových onemocnění předního segmentu oka
Moravíková, Jana ; Lišková, Petra (vedoucí práce) ; Krulová, Magdaléna (oponent)
V průběhu vývoje oka je klíčová exprese a regulace mnoha genů, přičemž úloha řady z nich, nebyla doposud zcela objasněna. Dysgeneze předního segmentu (DPS) oka jsou geneticky vysoce heterogenní skupinou onemocnění vykazující všechny typy Mendelovské dědičnosti, které se projevují jako variabilní kombinace vrozeného postižení rohovky, duhovky, komorového úhlu anebo čočky. Běžně prováděné testování kódujících úseků známých genů asociovaných s DPS, nevede k nalezení kauzální mutace u více než poloviny probandů. Lze se tedy domnívat, že existují dosud nepopsané příčinné varianty anebo geny. Molekulárně genetické vyšetření 12 českých probandů s DPS oka zahrnovalo analýzu přímým a celoexomovým sekvenováním. U mutací potenciálně narušující sestřih jsme provedli funkční analýzy pomocí metody Exon trappingu. U 4 probandů jsme nalezli v heterozygotním stavu 4 mutace v genu PAX6 c.183C˃G; p.(Tyr61*), c.1032+1G>A, c.1183+1G>T a c.622C>T; p.(Arg208Trp). Další probandka byla složeným heterozygotem v genu FOXE3 pro mutace c.244A>G; p.(Met82Val) a c.541delG; p.(Glu181Lysfs*26). U 7 probandů nebyly ve známých genech asociovaných s výskytem DPS detekovány žádné potenciálně patogenní varianty. Metodou Exon trappingu jsme prokázali, že mutace c.1032+1G>A a c.1183+1G>T narušují sestřih PAX6. Podrobná molekulárně...
|
host ::
RSS.