|
|
Studium fluorescenčních produktů v mitochondriích po napadení volnými radikály
Ivica, Joško ; Wilhelm, Jiří (vedoucí práce) ; Entlicher, Gustav (oponent) ; Drahota, Zdeněk (oponent)
Lipofuscinoidní pigmenty (LFP) jsou produkty reakcí, ve kterých volné radikály napadají molekuly s nukleofilními skupinami. LFP vznikají např. v reakcích mezi produkty rozkládaní peroxidů lipidů, což jsou hlavně reaktivní aldehydy, a sloučeninami obsahujícími aminoskupiny (fosfolipidy, peptidy). LFP lze snadno měřit díky jejich vnitřní fluorescenci. Tyto produkty jsou poměrně stabilní, a proto byly úspěšně využívány jako robustní markery oxidačního poškození. Provedli jsme metabolomické studie, přičemž LFP byly nejprve analyzovány fluorimetricky pomocí trojrozměrných a diferenciálních fluorescenčních spekter. Potom jsme LFP analyzovali pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie s cílem rozdělit směs látek na jednotlivé frakce. LFP jsme získali z izolovaných mitochondrií vystavených in vitrooxidačnímu stresu zahájenému různými spouštěči. LFP byly rovněž analyzovány v potkaních mozcích během časného rozvoje, což je doprovázeno přechodným zvýšením koncentrace kyslíku, a v erytrocytech z pacientů s Alzheimerovou chorobou. Vyvinuli jsme HPLC metodu pro kvalitativní analýzu LFP odlišného původu. Tato analýza objevila, že se LFP opravdu skládají z mnoha chromatograficky odlišných látek. Tímto způsobem jsme potvrdili jsoucnost velkého počtu jednotlivých fluorescenčních látek, jež se účastní patofyziologie...
|
|
|
Vliv ektopické syntézy mitochondriálního odpřahujícího proteinu 1 v bílé tukové tkáni na celotělový metabolizmus u myší
Janovská, Petra ; Kopecký, Jan (vedoucí práce) ; Drahota, Zdeněk (oponent) ; Kalous, Martin (oponent)
Prevence a léčba obezity patří mezi nejzávažnější problémy zdravotní péče. Mezi terapeutické cíle patří i metabolizmus tukové tkáně, jejíž hromadění je podstatou vzniku obezity. Pokusy na transgenních myších s ektopickou expresí hnědotukového odpřahujícího proteinu (UCP1) v bílé tukové tkáni prokázaly, že zvýšením výdeje energie v bílé tukové tkáni lze zabránit rozvoji obezity. Jedním z hlavních cílů dizertační práce byla detailní charakterizace fenotypu tohoto unikátního modelu myší rezistentních k obezitě. Ukázali jsme, že odpřažení mitochondriální oxidační fosforylace v bílé tukové tkáni vedlo ke zvýšení oxidace mastných kyselin, snížení lipogeneze a indukci mitochondriální biogeneze v této tkáni. Dále jsme se zaměřili na modulaci náchylnosti k rozvoji obezity zvýšením oxidace mastných kyselin v bílém tuku v reakci na fyziologický podnět, kombinovanou intervenci založenou na zvýšeném příjmu n-3 polynenasycených mastných kyselin (PUFA) a mírné kalorické restrikce, u myší krmených dietou s vysokým obsahem tuku. Synergická indukce mitochondriální oxidační kapacity a lipidového katabolizmu v epididymálním bílém tuku byla spojena s potlačením zánětlivé reakce této tkáně, která doprovází obezitu. Zlepšení lipidové (a glukózové) homeostázy bylo nezávislé na chladem indukované termogenezi (a UCP1) a souvisí s...
|
|
|
Studium molekulární a biochemické podstaty primární deficience koenzymu Q10
Spáčilová, Jana ; Veselá, Kateřina (vedoucí práce) ; Drahota, Zdeněk (oponent)
Tato diplomová práce se věnuje poruchám koenzymu Q10, které vedou ke snížení jeho koncentrace ve tkáních pacientů (tzv. deficience CoQ10). Zavádí dvě molekulárně-genetické metody pro analýzy deficience CoQ10 - skríningovou metodu High Resolution Melting Analysis pro usnadnění vytřídění potenciálních pacientů s mutací v genech PDSS1, PDSS2, COQ2, COQ9, CABC1 a APTX, které kódují některé z enzymů účastnících se biosyntézy CoQ10, a metodu přímého sekvenování kódujících sekvencí těchto genů a jim přilehlých intronních oblastí. Dále se snaží charakterizovat model deficience CoQ10 na in vitro kultivovaných lidských fibroblastech a linii HEK293. Deficience je v tomto případě navozena působením inhibitoru biosyntézy CoQ10 - kyseliny 4-aminobenzoové o koncentraci 1 mmol.dm-3 v médiu. Bylo zjištěno, že se po 4denním působení tohoto inhibitoru koncentrace CoQ10 u kultur fibroblastů a linie HEK293 snížila na 60 - 70 % kontroly, resp. 41 % kontroly v případě linie HEK293, přitom nedošlo ke změnám viability buněk ani morfologie mitochondriálních sítí. Zjistili jsme mírné zvýšení přítomnosti reaktivních forem kyslíku po kultivaci s inhibitorem, a to zejména superoxidových radikálů, ovšem ultrastruktura mitochondrií zřejmě zůstala nezměněna. V neposlední řadě se práce věnuje změnám aktivit komplexů dýchacího řetězce a...
|
|
| |
|
|
The Study of Molecular and Biochemical Bases of Cytochrome C Oxidase Deficiency
Veselá, Kateřina ; Zeman, Jiří (vedoucí práce) ; Farghali, Hassan (oponent) ; Drahota, Zdeněk (oponent)
Předkládaná práce vznikla v Laboratoři pro studium mitochondriálních poruch Kliniky dětského a dorostového lékařství 1.LF UK v Praze, která je diagnostickým centrem pro pacienty z České a Slovenské Republiky. V průběhu posledních let bylo v naší laboratoři diagnostikováno přes 40 pacientů s izolovanou poruchou aktivity cytochrom c oxidázy (COX). Molekulární podstata onemocnění byla objasněna pouze u 12 pacientů, kteří nesli patologické mutace v SURF1 genu. Vzhledem k tomu, že v současnosti neexistuje žádná adekvátní léčba těchto onemocnění, hraje v přístupu k postiženým rodinám klíčovou roli genetické poradenství a možnost prenatální diagnostiky. Skutečnost, že mitochondriální poruchy mohou mít dvojí genetický původ (geny kódovány mitochondriální nebo jadernou DNA), se kterým jsou spojené i specifické vlastnosti různých typů dědičnosti, genetické poradenství založené pouze na biochemickém potvrzení COX deficience je značně obtížné nebo dokonce zcela nemožné. Cílem naší práce byla snaha odhalit molekulární podstatu deficitu COX u našich pacientů. Kromě optimalizace metod pro rutinní skríning a nalezení několika patologických mutací v genech pro asemblační proteiny, jsme měli možnost studovat také tkáňový dopad těchto mutací z pohledu biochemického, strukturálního a histochemického.
|
|
| |
|
|
Úloha lipidů a ROS v kardioprotektivním mechanizmu chronické hypoxie
Balková, Patricie ; Nováková, Olga (vedoucí práce) ; Drahota, Zdeněk (oponent) ; Šmíd, František (oponent)
Úloha lipidů a reaktivních forem kyslíku v kardioprotektivním mechanizmu chronické hypoxie Kardiovaskulární choroby, zejména ischemická choroba srdeční je jednou z nejčastějších příčin morbidity a mortality ve vyspělých zemích. Jednou z možností, jak chránit srdce před ischemicko-reperfúzním poškozením je adaptace organizmů na hypoxické podmínky spojené s vysokou nadmořskou výškou. Dlouhodobá adaptace na chronickou hypoxii zvyšuje srdeční odolnost vůči akutnímu ischemicko-reperfúznímu poškození, což se projevuje zlepšením obnovy kontraktility srdce, zmenšením velikosti infarktu myokardu a snížením počtu a závažnosti srdečních arytmií. Adaptace organizmů na chronickou hypoxii je spojená se zvýšeným oxidačním stresem. Je známo, že v podmínkách akutní ischemie a reperfúze má oxidační stres škodlivé účinky na myokard, ale reaktivní formy kyslíku (ROS) tvořené v průběhu adaptace na chronickou hypoxii se naopak podílejí na indukci kardioprotekce. Výsledky naší studie ukázaly, že adaptace na chronickou hypoxii vede ke zvýšení aktivity i exprese manganové superoxiddismutázy (MnSOD) v srdečních mitochondriích potkana. Důkazem, že ve zvýšené regulaci tohoto enzymu jsou klíčové ROS, byly výsledky experimentu s antioxidantem N- acetylcysteinem (NAC), který redukoval jak zvýšenou aktivitu, tak i expresi MnSOD vyvolanou...
|
|
|
Mitochondriální cytochrom c oxidasa: inhibice kyanidem a vliv defektu asemblačního faktoru Surf1
Nůsková, Hana ; Kalous, Martin (oponent) ; Drahota, Zdeněk (vedoucí práce)
Aktivita mitochondriální cytochrom c oxidasy (COX, EC 1.9.3.1) může být ovlivněna jak faktory exogenními, tak endogenními. Nejúčinnější a v prostředí se nejhojněji vyskytující látkou, jež inhibuje COX, je kyanid. Velmi častá příčina lidské deficience COX je představována defektem v genu SURF1. Mechanismus inhibičního účinku kyanidu na COX stejně jako podmínky jeho zvratu nejsou zcela vysvětleny. Tři parametry funkce COX, jmenovitě transport elektronů (spotřeba kyslíku), transport protonů (mitochondriální membránový potenciál, m) a afinita ke kyslíku (hodnota p50), byly studovány s ohledem na inhibici KCN a její zvrat pyruvátem. Analyzována byla funkce COX v intaktních izolovaných mitochondriích jak v rámci dýchacího řetězce, tak jako samostatný enzym za použití sukcinátu nebo arteficielního elektronového donoru askorbát + TMPD. 250 M KCN zcela inhiboval elektron- i protontransportní funkci COX a tato inhibice byla plně reverzibilní, což se projevilo plnou aktivitou po promytí mitochondrií. Přidání 60 mM pyruvátu vyvolalo maximální obnovu obou parametrů pouze na 60 - 80 % původních hodnot. KCN o nízkých koncentracích do 5 M způsobil výrazný, třicetinásobný pokles afinity COX ke kyslíku. Tento pokles byl opět plně reverzibilní promytím mitochondrií, zatímco podání pyruvátu vedlo jen k částečné,...
|
|
|
The Role of Uncoupling in Down-regulation of Reactive Oxygen Species
Ježek, Jan ; Žáčková, Markéta (vedoucí práce) ; Modrianský, Martin (oponent) ; Drahota, Zdeněk (oponent)
Produkci superoxidu komplexem I lze tlumit odpřažením, které urychlí elektronový tok a protonové pumpování komplexu I. Za podmínek, kdy je znemožněné protonové pumpování komplexu I, např. v důsledku mutací mitochondriální DNA kódujicí podjednotku ND2, ND4 nebo ND5 komplexu I, podílející se na protonovém pumpování, by terapeutická intervence založená pouze na odpřažení nebyla účinná. V pokusech je model poruchy protonového pumpování simulován hydrofobním amiloridem EIPA. My jsme poprvé ukázali, že EIPA je inhibitor protonového pumpování i pro mitochondriální komplex I. Hledali jsme agens, jenž by na rozdíl od opřažení tlumilo oxidační stres v důsledku omezeného protonového pumpování komplexu I. Ubichinon cílený do mitochondrií MitoQ10 se pro tento účel ukázal být účinným antioxidantem při zvýšené produkci superoxidu způsobené zpomaleným elektronovým tokem na komplexu I. V souvislosti s prooxidačními účinky MitoQ10 je nutné jej při léčbě cílit do místa poškozené tkáně. Aktivací mitochondriální fosfolipasy iPLA2 mírným oxidačním stresem jsou uvolňovány hydroperoxidy mastných kyselin sloužící jako cyklující substráty pro UCP2, jenž mírným odpřažením zpětnovazebně tlumí produkci reaktivních sloučenín kyslíku. Buňky s nižším zastoupením oxidativní fosforylace adaptují méně účinně na podmínky fyziologické...
|
|
| |
host ::
RSS.