|
|
Kinetické vlastnosti β-N-acetylhexosaminidasy z rostlin tabáku
Valenta, Robert ; Ryšlavá, Helena (vedoucí práce) ; Šulc, Miroslav (oponent)
Částečnou purifikací z listů tabáku (Nicotiana tabacum L.) byla získána β-N- acetylhexosaminidasa o specifické aktivitě 1,72 µmol . min-1 . mg-1 se substrátem p- nitrofenyl-β-N-acetyl-D-glukosaminid. Izoelektrická fokusace a nativní elektroforéza odhalila jedinou izoformu enzymu. Byla stanovena relativní molekulová hmotnost gelovou chromatografií (MR 275 000) a nativní elektroforézou (MR 285 000). Dále byl stanoven izoelektrický bod (pI 5,3). Aktivita β-N-acetylhexosaminidasy byla stanovena se substráty p-nitrofenyl-β-N-acetyl-D-galaktosaminid i p-nitrofenyl-β-N-acetyl-D- glukosaminid, a dále se substráty N,N'-diacetylchitobiosa, p-nitrofenyl-N,N'- diacetylchitobiosid a N,N',N''-triacetylchitotriosa, pro které byla optimalizována metoda stanovení pomocí kapilární elektroforézy. S jednotlivými substráty bylo stanoveno pH (4,3-5,0) i teplotní optimum (50-55 řC), byl zdokumentován průběh reakce a identifikovány produkty reakcí. Aktivita β-N-acetylhexosaminidasy byla nejvyšší se substrátem p-nitrofenyl-β-N-acetyl-D-glukosaminid a nejnižší se substrátem N,N',N''- triacetylchitotriosa (35% při relativním srovnání). Se substráty p-nitrofenyl-β-N-acetyl-D- glukosaminid, p-nitrofenyl-β-N-acetyl-D-galaktosaminid a N,N'-diacetylchitobiosa byla stanovena maximální rychlost reakce a Michaelisova konstanta β-N-...
|
|
| |
|
|
Příprava mutantních forem fosfatidylinositol 4-kinasy IIα
Gregor, Jiří ; Šulc, Miroslav (vedoucí práce) ; Košek, Dalibor (oponent)
Fosfatidylinositol 4-kinasy (PI4K) jsou enzymy tvořící fosfatidylinositol-4-fosfát, který je důležitou regulační molekulou a prekursorem pro tvorbu dalších regulačních molekul. PI4K jsou zajímavé z medicínského hlediska, neboť je jejich funkce spojována s virovými, nádorovými, metabolickými a neurodegenerativními nemocemi. PI4K typu dva jsou inhibované vápenatými kationty, zatímco PI4K typu III takto inhibovány nejsou. Tato práce řeší vztah struktury a regulace funkce PI4K IIα, konkrétně regulaci vápenatými kationty. Cílem této práce bylo připravit mutovanou formu PI4K IIα, která by nebyla těmito kationty ovlivněna. Přestože se nepodařilo takovou formu připravit, bylo zjištěno, jak aminokyseliny N313, D346 a E193 ovlivňují aktivitu tohoto enzymu.
|
|
|
Studium teplotní citlivosti lidského TRPA1 kanálu
Barvíková, Kristýna ; Šulc, Miroslav (vedoucí práce) ; Černá, Věra (oponent)
Fyziologická detekce vnějších podnětů na periferních zakončeních primárních aferentních senzorických neuronů je zajišťována prostřednictvím specifické skupiny tzv. tranzientních receptorových potenciálových (TRP) kanálů. Současný rozvoj kryoelektronové mikroskopie a molekulárně-biologických technik umožňuje studovat funkci těchto specializovaných proteinů ve vztahu k jejich struktuře a pochopit tak lépe jejich fyziologickou úlohu a možnosti jejich farmakologického ovlivnění. Cílem předložené bakalářské práce je zpracovat souhrnný přehled současných poznatků o funkčních a strukturních vlastnostech ankyrinového TRP receptoru podtypu 1 (TRPA1), iontového kanálu aktivovaného různými dráždivými látkami a změnami okolní teploty. Experimentální část práce se zaměřuje na prozkoumání úlohy senzorové domény v teplotní citlivosti TRPA1. Výsledky získané pomocí elektrofyziologické techniky whole-cell patch-clamp prokazují, že senzor je důležitou oblastí určující proces otvírání a zavírání iontového kanálu. Mutace konzervovaného tyrosinu uprostřed senzorové domény pozměnila aktivační kinetiku závislou na membránovém potenciálu a zvýšila míru senzitizace chemických odpovědí při zvýšení teploty z 25 řC na 35 řC. (In Czech) Klíčová slova: TRP iontový kanál, ankyrinový receptor, nocicepce, struktura-funkce, karvakrol
|
|
|
Excitation of molecules by cold electrons
Šulc, Miroslav ; Horáček, Jiří (vedoucí práce) ; Čárský, Petr (oponent) ; Čížek, Martin (oponent)
Název práce: Excitace molekul studenými elektrony Autor: Miroslav Šulc Katedra / Ústav: Ústav teoretické fyziky, Univerzita Karlova v Praze Vedoucí disertační práce: prof. RNDr. Jiří Horáček, DrSc., Ústav teoretické fyziky, Univerzita Karlova v Praze Abstrakt: Pozornost je věnována vybraným metodám pro popis nízkoenergetických elektron-molekulových srážek. První část práce se zabývá aplikací metody R-matice v kombinaci se Schwinger-Lanczos variačním principem pro potenciálový rozptyl v pří- padě dalekodosahových interakcí. Další sekce se zaobírají aspekty konstrukce ko- relačně-polarizačního potenciálu v metodě Discrete Momentum Representation (DMR) s využitím prostředků aproximace lokální hustoty v kontextu teorie funkcionálu hus- toty (DFT). Získané poznatky jsou následně aplikovány pro body-frame výpočty na úrovni aproximace statické výměny se zahrnutou polarizací (SEP) v rámci analýzy ex- perimentálních dat pro e−-N2 srážky představující součást širšího projektu věnovaného studiu rotačních excitací malých molekul v plynné fázi iniciovaných srážkami s elek- trony. V případě N2 bylo pozorováno potlačení dozadního průřezu pro energie pod 95 meV zdůvodnitelné z teoretického hlediska destruktivní...
|
|
|
Studium mikroRNA u pacientů se spinocelulárními karcinomy hlavy a krku
Hudcová, Kristýna ; Šulc, Miroslav (oponent)
Hledání markerů nemocí je v popředí vědeckého zájmu. Biomarker specifické nemoci by měl sloužit jako pomocník při léčbě dané nemoci - ať už pro diagnostiku onemocnění nebo pro prognózu jejího průběhu. V naší studii jsme se zaměřili na využití mikroRNA - krátkých RNA, které svým nasedáním na mRNA regulují průběh exprese jednotlivých proteinů. MiRNA jsou předmětem studia díky jejich stabilitě a funkci v regulaci mnoha buněčných procesů. V neposlední řadě mají možné uplnatění jako biomarker u mnoha onemocnění. V našem případě to jsou spinocelulární nádory hlavy a krku (HNSCC). Jelikož je tento druh nádorového onemocnění široce rozšířen a klinicky významné markery zde chybí, je naším zájmem hledat nové druhy markerů, umožňujících včasnou diagnostiku nemoci a co nejpřesnější stanovení prognózy. Vybrali jsme 3 kandidátní miRNA (miR-29c-3p, miR-200b-5p, miR-375-3p), u kterých jsme metodou qRT-PCR provedli profilaci jejich expresí ve tkáních pacientů s HNSCC. Expresi miRNA ve 42 vzorcích nádorové tkáně jsme porovnali s expresí miRNA ve tkáních přiléhajících k nádoru. Tkáň obklopující nádor je zajímavá z hlediska svých vlastností, histologicky vypadá jako tkáň zdravá, ale při bližším zkoumání tomu tak není. Je ovlivněna tkání nádorovou a může přispívat k progresi nádoru. Podařilo se nám rozlišit tyto dvě...
|
|
|
Klinicky relevantní protein-proteinové interakce v procesu bakteriální patogeneze B. pertusis
Málek, Albert ; Šulc, Miroslav (vedoucí práce) ; Černá, Věra (oponent)
Výskyt černého kašle v lidské populaci byl v průběhu 20. století díky vakcinaci silně potlačen. V posledních letech však začala inicidence černého kašle opět narůstat. Původcem této nemoci je patogenní gramnegativní bakterie Bordetella pertussis, která začíná být rezistentní vůči dosud používaným antibiotikům či vakcínám. B. pertussis napadá dýchací cesty člověka. Jedním z jejích virulentních faktorů je adenylátcyklázový toxin (ACT). Ten je sekretován z bakteriálních buněk do extracelulárního prostoru, váže se na plasmatickou membránu hostitelské buňky a translokuje do jejího cytosolu adenylátcyklázovou doménu (dAC). Tato enzymatická doména se aktivuje nekovalentní interakcí s eukaryotním kalmodulinem (CaM) a syntetizuje cAMP, jehož nadbytek má za následek apoptózu hostitelské buňky. Proteinovou interakci dAC s CaM jsme studovali pomocí metody PIXL (fotochemické zesítění, z angl. "Photo Induced Cross Linking") a hmotnostní spektrometrie (MS). Mutantní protein dAC, s inkoroporovaným foto-Methioninem (pM) na pozici Leucinu 240 (dACL240pM), jsme exprimovali v transformovaných buňkách E. coli B834 v minerálním médiu s pM. Exprimovaný protein jsme izolovali afinitní chromatografií a pomocí MS stanovili inkorporaci pM do primární struktury dAC na přibližně 50 % ve finálním preparátu. S izolovaným...
|
|
| |
|
|
Rekombinantní příprava proteinu RhoA s afinitní sondou.
Filipová, Barbora ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Šulc, Miroslav (oponent)
Počet střevních infekcí spojených s užíváním antibiotik u lidí rapidně roste. Virulentní toxiny C. difficile, Yersinií a mnoha dalších bakterií cílí na protein RhoA. Jedná se o GTPasu, která je součástí signálních buněčných drah a její hlavní funkcí je regulace aktinového cytoskeletu. Zmíněné toxiny činí tento protein nefunkčním, což může vést až k fatální destrukci buňky. V dnešní době je diagnostika popsaných infekcí nedostačující. Využití proteinových čipů a hmotnostní spektrometrie k určení modifikace proteinu RhoA se jeví jako možný způsob stanovení těchto střevních bakteriálních onemocnění. A proto je cílem této práce rekombinantně připravit kýžený protein RhoA s navázanou afinitní sondou, která bude sloužit k jeho imobilizaci na biočip. Takto připravený protein bude dále využit v diagnostice popsaných onemocnění.
|
|
|
Study of structure and interaction of human lymphocyte receptors
Bláha, Jan ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Šulc, Miroslav (oponent) ; Obšil, Tomáš (oponent)
Přirozené zabíječské (Natural killer, NK) buňky jsou důležitou složkou imunitního systému poskytující dohled nad viry infikovanými, stresem transformovanými nebo rakovinnými buňkami. Receptory NKR-P1 a jejich přirozené ligandy z genové rodiny clec2 představují alternativní "missing-self" NK buněčný systém rozpoznávání, založený na interakci vysoce příbuzných receptorů podobných C-lektinům. Lidské NKR-P1 bylo objeveno před vice než dvaceti lety, přesto stále zůstává jediným lidským orthologem této receptorové rodiny početné především u hlodavců. Po navázání na svůj přirozený ligand LLT1 receptor NKR-P1 může předávat inhibiční nebo kostimulační signály. Pro svou potenciální roli v imunitním úniku nádorů a autoimunitě jsou zajímavými cíli výzkumu, přesto je povaha jejich interakce stále nejasná. Abychom objasnili strukturní povahu jejich interakce, vyvinuli jsme obecně použitelnou metodu pro rekombinantní expresi lidského NKR-P1 a LLT1 a jejich homologů založenou na transfekci buněčné linie HEK293S GnTI- . Popsali jsme stabilizující mutaci His176Cys umožňující přípravu vysoce stabilního rozpustného receptoru LLT1. Připravený receptor LLT1 a lidské NKR-P1 jsme vykrystalizovali v různých glykosylačních stavech jednak samostatně a také v jejich komplexu. Struktury LLT1 i NKR-P1 obsahují klasické...
|
host ::
RSS.