|
|
Produkce a purifikace rekombinantního receptoru Clrb
Prokopová, Tereza ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Černá, Věra (oponent)
Přirozeně cytotoxické buňky hrají zásadní roli v nespecifické imunitě. I bez antigenně specifických receptorů na svém povrchu jsou schopny výkonné obranyschopnosti. Rozeznávají jak "cizí", tak tělu vlastní molekuly, respektive absenci tělu vlastních molekul, konkrétně MHC glykoproteinů I. třídy, na površích cílových buněk. Jsou schopny rozeznat virem napadené a nádorové buňky v organismu. Pokud dojde ke kontaktu s buňkou nesoucí abnormálně málo MHC glykoproteinů I. třídy, je to pro přirozenou zabíječskou buňku ("natural killer cell", NKC) signál, že tato buňka je například napadená virem. I bez předchozí stimulace, proliferace a diferenciace NK buňka spouští apoptózu cílové buňky. Je také schopna spustit zánětlivé reakce produkcí chemokinů a cytokinů. Výsledná reakce je vždy souhrou aktivačních a inhibičních signálů, které buňka přijímá ze svého okolí. Nejnovější výzkumy ukazují, že cílená modulace NK buněk vede ke zmírnění komplikací při transplantaci kostní dřeně. Zároveň mají potenciál v imunoterapiích, např. při léčbě autoimunitních onemocnění. Z tohoto důvodu jsou NK buňky velmi studovanou skupinou buněk. Tato práce se zabývá produkcí Clrb ("C-type-lectin-related protein b"). Tento protein je ligandem pro inhibiční receptor potkaních NK buněk NKR-P1B. Pokud napadená buňka na svém povrchu...
|
|
|
Produkce myšího NK buněčného receptoru NKR-P1C a hledání jeho ligandu
Pucholtová, Helena ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Černá, Věra (oponent)
Přirození zabíječi neboli NK buňky jsou buňky imunitního systému, zprostředkovávající vrozenou imunitu proti patogenům a nádorům, aniž by musely být předem vystaveny antigenu. Zastávají tak okamžitou protivirovou obranu již během počáteční fáze, tedy před zahájením tvorby protilátek a před vývojem specifických cytotoxických T-lymfocytů. Na svém povrchu mají NK buňky širokou škálu inhibičních a aktivačních receptorů, jejichž významnou rodinou jsou receptory podobné lektinům C - typu, z nichž byla první objevena právě rodina NKR-P1 ("natural killer cell receptor - protein 1"). Tato práce se zabývá přípravou/studiem myšího NK buněčného aktivačního receptoru NKR-P1C a hledáním jeho vazebného partnera. Rozpustná forma proteinu NKR-P1C byla připravena rekombinantní expresí pomocí tranzientní transfekce buněčné linie HEK293 (human embryonic kidney 293) s divokou, či jednoduchou glykosylací jako IgG-Fc fúzní protein, z nějž bylo možné po afinitní purifikaci, štěpení TEV proteasou a následnou HPLC chromatografií získat čistý dimer NKR-P1C. Dimernní forma proteinu byla následně využita na strukturní studium pomocí krystalizačních pokusů. Na fúzní protein byl navázán protein A značený fluorescenční sondou DyLight 488. Tímto komplexem byly značeny myší tkáně a buněčné linie za účelem hledání ligandu.
|
|
|
Cell signalling and molecular complexes of the TRH receptor
Drastichová, Zdeňka
První část disertační práce se zabývá identifikací proteinů isolovaných ve frakci obohacené o plasmatické membrány získané z buněčné linie HEK293-E2M11, jejichž hladina byla změněna po dlouhodobém působení thyroliberinem. Pomocí imunoblotu se specifickými protilátkami proti Na+ ,K+ - ATPase a vazebných pokusů s [3 H]TRH a [35 S]GTPγS bylo zjištěno, že frakce obohacená o plasmatické membrány obsahovala v porovnání s postnukleárním supernatantem výrazně vyšší množství Na+ ,K+ - ATPasy, TRH receptoru and G-proteinů. Pro detekci a identifikaci proteinů ve frakci obohacené o plasmatické membrány, jejichž hladiny byly po dlouhodobém působení TRH (16 h; 10 μM) změněny, byly použity 2D-elektroforéza a hmotnostní spektrometrie. Bylo identifikováno 42 proteinů, z nichž pět proteinů (mitofilin, MTHSP75, prohibitin, stomatin like-2, peroxiredoxin III) představuje mitochondriální proteiny, které jsou důležité pro správnou strukturu a funkci mitochondrií. Hladina těchto proteinů byla zvýšena po dlouhodobém působení TRH, a proto lze usuzovat, že dlouhodobé působení TRH může výrazně ovlivnit mitochondriální membránu a funkci mitochondrií. Druhá část disertační práce se zabývá identifikací molekulárních komplexů TRH receptoru a/nebo Gq/11 proteinu. Pomocí nativní elektroforézy byly identifikovány tři komplexy...
|
|
|
Příprava expresních vektorů pro NKp65 a KACL, nových zástupců rodiny lidských NK buněčných receptorů
Mikulová, Barbora ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Hlouchová, Klára (oponent)
NK buňky (natural killer cells, "přirození zabíječi") jsou významnou složkou vrozeného imunitního systému a mají schopnost rozpoznat a zabít především nádorové a virem infikované buňky. Na svém povrchu mají celou řadu inhibičních a aktivačních receptorů, pomocí kterých rozhodují o osudu cílových buněk. Imunitní odpověď je nejčastěji spuštěna po navázání NK buněčného receptoru na svůj ligand. Takovými receptor-ligandovými systémy jsou např. NKp80-AICL a NKRP1-LLT1 na lidských lymfocytech. Další receptor-ligandový pár představují NKp65 a KACL, dva nedávno objevené lektinové receptory lidských imunocytů. NKp65, blízký příbuzný NKp80, je glykoprotein, který funguje jako aktivační imunoreceptor na NK92MI buňkách. KACL je posledním objeveným členem lidské rodiny receptorů CLEC2 a je lokalizován téměř výhradně v kůži. Pomocí povrchové plazmonové rezonance bylo zjištěno, že NKp65 je vysokoafinitní receptor pro KACL. Cílem mé bakalářské práce bylo připravit expresní vektory kódující lidské NK buněčné receptory NKp65 a KACL, produkovat tyto proteiny v expresním systému HEK293T buněk a provést jejich purifikaci. Klíčová slova: NKp65, KACL, NK buňka, lektin, receptor, plazmid
|
|
|
Cell signalling and molecular complexes of the TRH receptor
Drastichová, Zdeňka ; Novotný, Jiří (vedoucí práce) ; Hodný, Zdeněk (oponent) ; Říčný, Jan (oponent)
1 Souhrn První část disertační práce se zabývá identifikací proteinů isolovaných ve frakci obohacené o plasmatické membrány získané z buněčné linie HEK293-E2M11, jejichž hladina byla změněna po dlouhodobém působení thyroliberinu (TRH). Pomocí techniky imunoblotu se specifickými protilátkami proti Na,K-ATPase a vazebných pokusů s [3 H]TRH a [35 S]GTPγS bylo zjištěno, že frakce obohacená o plasmatické membrány obsahovala v porovnání s postnukleárním supernatantem výrazně vyšší množství Na,K-ATPasy, TRH receptoru and G-proteinů. Pro detekci a identifikaci proteinů ve frakci obohacené o plasmatické membrány, jejichž hladiny byly po dlouhodobém působení TRH (16 h; 10 μM) změněny, byly použity 2D elektroforéza a hmotnostní spektrometrie. Bylo identifikováno 42 proteinů, z nichž pět (mitofilin, MTHSP75, prohibitin, stomatin like-2, peroxiredoxin III) představuje mitochondriální proteiny, které jsou důležité pro zajištění správné struktury a funkce mitochondrií. Hladina těchto proteinů byla zvýšena po dlouhodobém působení TRH, a proto lze usuzovat, že dlouhodobé působení TRH může výrazně ovlivnit mitochondriální membránu a funkci mitochondrií. Druhá část disertační práce se zabývá identifikací molekulárních komplexů TRH receptoru a/nebo Gq/11 proteinu. Pomocí nativní elektroforézy byly identifikovány tři komplexy...
|
|
| |
|
| |
|
|
Opioidní receptory a jejich signální systém v myokardu
Ladislav, Marek ; Novotný, Jiří (vedoucí práce) ; Neckář, Jan (oponent)
Hlavním cílem této bakalářské práce je shromáždit a systematicky seřadit poznatky o opioidních receptorech a jejich signálním systému v myokardu. Činnost srdce je však řízena především adrenergní signalizací a tato práce proto obsahuje také údaje týkající se vlastností a významu dalších důležitých receptorů. Pro lepší obecné porozumění a v rámci shrnutí lze v této práci také nalézt všeobecné základní informace o opioidním systému, především o receptorech a jejich signalizaci. O opioidních receptorech v myokardu se toho stále příliš mnoho neví, a to přesto, že především za různých patofyziologických okolností by opioidní systém mohl mít velmi důležitou úlohu. Důvodů může být několik. Možnost bližší charakterizace opioidních receptorů v myokardu je poměrně obtížná vzhledem k relativně malému množství těchto receptorů v srdeční tkáni. Situaci také poněkud komplikují určité mezidruhové rozdíly, které v modulaci funkce srdce panují. Dosud není zcela objasněn úplný mechanismus, kterým opioidní receptory působí na myokard. Především u lidí by toto poznání mohlo být klíčové, protože tyto receptory, resp. jejich ligandy, by se daly využít k lékařským účelům.
|
|
|
Role of DD- and DED-containing adaptor proteins in apoptotic signaling
Čaja, Fabián ; Janštová, Vanda (oponent) ; Anděra, Ladislav (vedoucí práce)
Proteíny obsahujúce zväzok šiestich antiparalelných α-helixov, tzv. doménu smrti (death domain, DD) a jej podobné domény (DED, CARD), patria k významným regulátorom apoptotickej signalizácie. Zaraďujeme medzi ne povrchové receptory z rodiny TNFR, ktoré prijímajú proapoptotický signál, ale aj adapterové proteíny a ďalšie enzýmy ako proteíny a kinázy. Tieto receptory nazývané "receptory smrti" interagujú s adapterovými proteínmi obsahujúcimi DED alebo DD, ktoré následne prenášajú signál na iniciačné kaspázy a tie aktivujú ďalšie zložky apoptotickej signalizačnej kaskády. DEDs a DDs sú súčasťou aj ďalších proteínov, ktoré regulujú aktiváciu kaspázovej signalizácie alebo sa zúčastňujú iných neapoptotických signalizácií. Ako bolo popísané na viacerých experimentálnych modeloch, defekty a deregulácie proteínov obsahujúcich DDs a DEDs sú často veľmi závažné až letálne. Najčastejšie sa prejavujú nádorovým bujnením, imunodeficienciami, poruchou správneho vývoja mnohých orgánov a v neposlednom rade aj poruchami expresie určitých génov.
|
|
| |
host ::
RSS.