|
|
Ramanova spektroskopie prokaryotních buněk
Večeríková, Paula ; Bernatová,, Silvie (oponent) ; Samek, Ota (vedoucí práce)
Predkladaná bakalárska práca sa zaoberá Ramanovou spektroskopiou bakteriálnych buniek. Táto metóda sa ukazuje ako veľmi vhodná na sledovanie kultivačných podmienok týchto bakteriálnych kmeňov, pretože je vo svojej podstate nedeštruktívna a rýchla v porovnaní s plynovou chromatografiou. Vďaka nedeštruktívnemu charakteru je možné zmerané bunky ďalej kultivovať. Túto analytickú metódu je ďalej možné využiť k triedeniu a výberu jedincov so zvýšenou schopnosťou tvorby PHB. Týmto výberom by bolo potom možné vybrať generáciu tzv. superproducentov PHB. Polyhydroxybutyrát (PHB) patrí do skupiny polyhdroxyalkanoátov (PHA), ktoré slúžia ako náhrada plastov z petrochemického priemyslu, ktorých spotreba narastá obzvlášť v dobe pandémie. Súčasne biodegradabilné náhrady sú na báze škrobu, čím však dochádza ku odčerpávaniu nutričného materiálu pre ľudí a zvieratá. Táto bakalárska práca môže slúžiť ako podklad ku zníženiu ceny výroby PHB, keďže výsledky môžu byť použité pri kultivácií buniek ako senzor obsahu PHB v reakcií na kmeň baktérií. V experimentálnej časti práce boli premerané Ramanové spektrá vybraných baktérií, kde výsledok ukázal najväčšiu odozvu pre PHB u Chelatococcus shambunathi a najnižšiu u termofilný izolát BZ (Paenibacillus sp.). Kvantitatívna informácia o obsahu PHA v baktériách bola zistená plynovou chromatografiou, kde najvyšší obsah mala baktéria – Chelatococcus shambunathi a naopak najnižší Termobacillus composti. Predmetom druhej časti bolo oddelenie zmesi dvoch bakteriálnych kultúr produkujúcich a neprodukujúcich PHA. Výsledkom bol jednoznačný dôkaz, že zmes je oddeliteľná na základe intenzity vybraného triediaceho parametra.
|
|
|
Identifikace a izolace PHA produkujících bakterií
Pernicová, Iva ; Ondrejovič, Miroslav (oponent) ; Rychtera, Mojmír (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Polyhydroxyalkanoáty (PHA) jsou mikrobiální zásobní polyestery, které mohou představovat obnovitelnou a ekologicky šetrnou alternativu k petrochemickým plastům. Jejich výroba a využití jsou do velké míry znevýhodněny vysokou produkční cenou. Jednou z možností, jak snížit cenu produkce PHA, je využití extrémofilních PHA producentů, které s sebou přináší především výhody vyplývající z vysoké robustnosti procesu vůči mikrobiální kontaminaci. V předložené práci byla pozornost zaměřena na studium produkce PHA pomocí vybraných halofilních a termofilních mikroorganismů. Z halofilních mikroorganismů byly testováni především vybraní sbírkoví zástupci rodu Halomonas, a to vzhledem k jejich možnému využití k produkci PHA z levného odpadního fritovacího oleje. Byli identifikováni dva slibní PHA producenti, a to konkrétně Halomonas hydrothermalis a Halomonas neptunia. Oba kmeny dosahovaly v rámci baňkových experimentů solidních výtěžků PHA a při přídavku vhodných strukturních prekurzorů byly také schopny produkce kopolymerů se zajímavými materiálovými vlastnostmi. Hlavní důraz byl však v práci kladen na studium produkce PHA pomocí termofilních mikroorganismů. V rámci práce byla provedena izolace termofilních PHA producentů z různých termofilních konsorcií (aktivní kal, kompost atd.). V průběhu izolačních experimentů byl navržen originální izolační postup využívající změny osmotického tlaku tzv. osmoselekce. Touto originální cestou bylo získáno několik desítek slibných termofilních producentů PHA, kteří byli taxonomicky zařazeni pomocí sekvenace genu 16S rRNA a byl u nich testován PHA produkční potenciál. Nejslibnějším PHA producentem byl izolát klasifikovaný jako Aneurinibacillus sp. H1. K produkci PHA pomocí Aneurinibacillus sp. H1 lze využít řadu substrátů včetně odpadního glycerolu. Ještě významnější je schopnost syntetizovat kopolymery s vysokým obsahem 4-hydroxybutyrátu. Monomerní složení PHA kopolymeru, a tím i materiálové vlastnosti připraveného kopolymeru, je možné kontrolovat vhodným nastavením kultivačních podmínek. Připravený kopolymer P(3HB-co-4HB) má unikátní vlastnosti a velký aplikační potenciál v řadě high-end aplikací například v oblasti péče o zdraví, potravinářství nebo kosmetice.
|
|
|
Complementary analysis of procaryotic cells by electron microscopy and Raman spectroscopy
Ikrényiová, Terézia ; Sedláček, Petr (oponent) ; Hrubanová, Kamila (vedoucí práce)
This master thesis deals with conventional methods of bacterial cell analysis, polyhydroxyalkanoates, Raman spectroscopy and electron microscopy in the theoretical part. The production of polyhydroxybutyrate by selected thermophilic bacteria and their analysis by gas chromatography, cryogenic scanning electron microscopy and Raman spectroscopy is described in the experimental part. The chosen sample was analyzed by a transmission electron microscope. Comparing the results from previous mentioned methods it was found that the bacteria Schlegelella thermodepolymerans accumulated the highest amount of PHB. The lowest amount of PHB was obtained by bacteria Rubrobacter xylanophilus. The assumption that the PHB granules formed so-called needle-like plastic deformations during freeze-fracturing was affirmed by cryo-SEM photos analysis. Moreover, it was found that the bacterial cell characterization deduced from microscopic observation of samples corresponded to the description in the literature. TEM provided better resolution photos and in consequence the cells and PHB are more visible. The thesis is also focused on chemical fingerprint analysis of cells by Raman spectroscopy. Several biomolecules were identified by measured Raman spectra for the particular samples.
|
|
|
production of PHA by selected extremophilic bacteria
Šarköziová, Patrícia ; Slaninová, Eva (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
This bachelor´s thesis deals with production of polyhydroxyalkanoates (PHA) by thermophilic bacterial strains of Chelatococcus composti and Chelatococcus sambhunathii. We were finding out the best conditions for production of PHA granules inside the cells. In the beginning of the experiment we employed PCR to detect the phaC gene, encoding for PHA synthase, which is requisite for production of PHA. We also analyse the best source of carbon, optimal temperature for production of polyhydroxyalkanoates and influence of chosen precursors to grow of biomass and production of copolymers. The last part of this experimental thesis deals with research utilization of selected model hydrolysates. Glucose was the best source of carbon for both bacteria Chelatococcus composti and Chelatococcus sambhunathii and optimal temperature for grow and production of P(3HB) was 45°C. The applied precursors inhibited cell grow, but both bacterial strains Chelatococcus composti and Chelatococcus sambhunathii could produce copolymer P(3HB-co-3HV) after additiong of precursors sodium propionate and valeric acid. For both bacterial strains was the most useful model hydrolysates, which contains the biggest part of glucose. Morever, bacterial cells containing PHA granules were observed by fluorescence and transmission electron microscopy.
|
|
|
Molekulárně biologická charakterizace vybraných producentů PHA
Kubáčková, Eliška ; Brázda, Václav (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Diplomová práce se zabývá molekulárně biologickou charakterizací vybraných producentů polyhydroxyalkanoátů (PHA). V rámci práce byly pomocí molekulárně biologických metod identifikovány a charakterizovány PHA produkující termofilní izoláty pocházející ze vzorků aktivovaného kalu a kompostu. Sekvenací 16S rRNA genu byly termofilní izoláty identifikovány a taxonomicky zařazeny do kmene bakterií Firmicutes. U těchto bakteriálních izolátů byla stanovena schopnost produkce PHA na úrovni genotypu pomocí konvenční PCR detekcí phaC genu kódujícího PHA syntázu, který je klíčovým enzymem biosyntézy PHA. U většiny izolovaných bakterií byly detekovány PHA syntázy I., II. a IV. třídy, přičemž PHA syntázy tříd I a II nejsou pro detekované rody bakterií charakteristické. Největšího zastoupení izolátů představoval druh termofilní bakterie Aneurinibacillus thermoaerophilus, u kterého byla detekována PHA syntáza IV. třídy. V druhé části diplomové práce byla zavedena metoda RT-qPCR pro studium exprese vybraných genů bakterie Cupriavidus necator H16 zapojených do metabolismu PHA. V rámci zavedení metody byla provedena optimalizace PCR detekce vybraných genů a optimalizována kvantifikace genů pomocí real-time PCR. Testovaná metoda zahrnovala kroky izolace RNA, syntézu cDNA a kvantifikaci úseků genů, u nichž byly na základě získaných dat stanoveny kritické body metody.
|
|
|
Biotransformace kyseliny ferulové na senzoricky aktivní látky
Opial, Tomáš ; Pernicová, Iva (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Bakalárska práca sa zaoberala biotransformáciou kyseliny ferulovej na senzoricky aktívne látky. Experiment bol založený na sledovaní biotransformačného potenciálu vybraných mikroorganizmov metódou vysoko účinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC) pričom kultivácia prebiehala v dvoch paralelných prevedeniach a vzorky s pridanou kyselinou ferulovou boli rozdelené na 24 hodinové pôsobenie a 48 hodinové pôsobenie kyseliny ferulovej na bakteriálne kultúry. Bolo zistené, že termofilné baktérie a halofilná baktéria Halomonas neptunia sú najvhodnejšími kandidátmi na biotransformáciu kyseliny ferulovej na senzoricky aktívne látky. Pri oboch vzorkách baktérii Schlegelella thermodepolymerans (DSM 15344 a DSM 15264) došlo k vzniku 33 mg/l a 76 mg/l kyseliny vanilovej a 81 mg/l a 71 mg/l 4-vinylguaiacolu po 24 hodinovom pôsobení kyseliny ferulovej. U vzorky s baktériou T. taiwanensis po 48 hodinovom pôsobení kyseliny ferulovej vzniklo 61 mg/l kyseliny vanilovej a 32 mg/l 4-vinylguaiacolu a u vzorky R. xylanophilus 56 mg/l 4-vinylguaiacolu. U vzorky s baktériou H. neptunia po 24 hodinovom pôsobení kyseliny ferulovej došlo k jej premene na 296 mg/l kyseliny vanilovej, čo činilo až 59% konverzie pôvodnej kyseliny ferulovej a u vzorky s baktériou H. organivorans po 24 hodinovom pôsobení kyseliny ferulovej vzniklo 71 mg/l kyseliny vanilovej. Avšak po 48 hodinovom pôsobení kyseliny ferulovej kyselina vanilová degradovala. Okrem screeningu biotransformačného potenciálu sa vykonalo aj porovnanie sekvencie bakteriálnych enzýmov, podieľajúcich sa na biotransformácii, s proteínovými sekvenciami v databáze pomocou vyhľadávacieho nástroja BLAST. Prítomnosť génov kódujúcich enzýmy podieľajúcich sa na biotransformácii bola dokázaná takmer pre všetky používané mikroorganizmy okrem baktérie H. neptunia, pre ktorú nebol dokázaný ani jeden gén. Najväčší počet prítomných génov u baktérii bol pri enzýmoch feruloyl-CoA-syntetáza, enoyl-CoA hydratáza/izomeráza, acetoacetyl-CoA thioláza a vanilín dehydrogenáza.
|
|
|
Screening produkce biosurfaktantů u vybraných termofilních bakterií
Řeháková, Veronika ; Nováčková, Ivana (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Předmětem bakalářské práce je produkce biosurfaktantů vybranými termofilními bakteriemi. Teoretická část obsahuje obecnou charakterizaci termofilních bakterií, popisuje struktury a klasifikaci biosurfaktantů, charakterizuje jejich vlastnosti a využití. Závěr teoretické části se věnuje produkci biosurfaktantů termofilními bakteriemi. Experimentální část se zabývá screeningem produkce biosurfaktantů u vybraných termofilních bakterií. Termofilní bakterie byly získány z kompostů a aktivovaných kalů. Izolace není předmětem bakalářské práce. Celkově 39 bakteriálních izolátů bylo kultivováno a supernatanty kultivačního média byly testovány screeningovými metodami na přítomnost biosurfaktantů, a to stanovením aktivity emulze a solubilizací krystalického antracenu. Na základě výsledků těchto metod bylo vybráno 14 nejatraktivnějších producentů. Vybrané bakteriální kmeny byly znovu kultivovány a byla tak získána nová sada supernatantů. Pro podrobnější screening produkce vybranými termofilními bakteriemi byly kromě stanovení aktivity emulze a solubilizace krystalického antracenu přidány další metody: přímé měření povrchového napětí – Du-Noüy-Ring, metoda rozlévání kapky a metoda rozšiřování oleje. Výsledky byly zhodnoceny a metody byly znovu zopakovány pro novou sadu supernatantů za účelem ověření reprodukovatelnosti produkce. Výsledky všech testů byly porovnány a následně byli určeni tři nejspolehlivější termofilní bakteriální producenti.
|
|
|
Využití termofilních bakterií k biodegradaci syntetických a přírodních polymerů
Csölle, Eduard ; Sedlář, Karel (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce se zabývá využitím termofilní bakterie Schlegelella thermodepolymerans k biodegradaci vybraných polymerů, mezi které patří poly(3-hydroxybutyrát) (PHB), polyester kyseliny mléčné (PLA) a poly(butylen adipát-co-tereftalát) (PBAT). V teoretické části práce jsou přiblíženy vlastnosti a původ těchto bioplastů, charakteristika studovaných bakterií a celkový průběh biodegradačního procesu. Experimentální část je zaměřena na dvacetidenní kultivaci tří testovaných kmenů v přítomnosti zmíněných polymerů a následné zhodnocení míry degradace těchto materiálů. Největší nárůst biomasy byl pomocí spektrofotometrie pozorován u kmene DSM 15344 při kultivaci na PHB. Díky slepým vzorkům (bez polymerů) bylo prokázáno, že pro významnější růst musely bakterie opravdu utilizovat přítomné polymery. Gravimetrická analýza obsahu biomasy potvrdila, že nejvhodnějším substrátem pro kultivaci byl PHB. Největší hmotnostní ztráty byly zaznamenány u PHB a pohybovaly se v rámci všech tří kmenů okolo 30 %. U kmene LMG 21645 činil úbytek téměř 33 %. Hmotnostní ztráty PLA a PBAT dosahovaly znatelně nižších hodnot. Přesto byl pomocí SEC-MALS zaznamenán nejvýraznější pokles molekulové hmotnosti právě u PLA, a to asi 80 % u kmene DSM 15264. Analýza povrchu polymerů využitím SEM potvrdila, že biodegradace PHB probíhá formou povrchové enzymatické eroze. Naopak u vzorků PLA a PBAT se biodegradace neprokázala.
|
|
|
Studium metabolických vlastností bakterie Schlegelella thermodepolymerans v kontextu biosyntézy polyhydroxyalkanoátů
Chvátalová, Viktorie ; Kouřilová, Xenie (oponent) ; Pernicová, Iva (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce se zabývá metabolickými vlastnostmi termofilní bakterie Schlegelella thermodepolymerans, která je schopná produkovat polyhydroxyalkanoáty (PHA). Cílem práce bylo pochopení metabolismu a utilizace různých sacharidů (xylóza, celobióza, glukóza a jejich kombinace) v závislosti na čase kultivace. V experimentální části byly použity dva bakteriální kmeny (M15344 a DSM15344). U bakterií byl v průběhu měření sledován nárůst optické hustoty. Dále byl stanoven obsah P(3HB) z biomasy pomocí GC-FID a molekulová hmotnost polymeru pomocí analýzy SEC-MALS. Díky měření zbytkového cukru pomocí HPLC-RI byl stanoven průběh utilizace sacharidů v závislosti na čase. Výsledky obou bakterií byly mezi sebou porovnány a vyhodnoceny. Bakterie DSM15344 prokazovala vyšší výsledky při produkci P(3HB) než bakterie M15344 a jako nejvhodnější substráty pro produkci P(3HB) se jeví celobióza a xylóza.
|
|
|
Produkce kopolymerů na bázi polyhydroxyalkanoátů pomocí bakterie Schlegelella thermodepolymerans
Černý, Vojtěch ; Černayová, Diana (oponent) ; Pernicová, Iva (vedoucí práce)
Cílem této práce bylo prostudovat schopnost různých kmenů termofilní bakterie Schlegelella thermodepolymerans inkorporovat do struktury polyhydroxyalkanoátů (PHA) různé monomerní jednotky a tvořit tak kopolymery. Byly testovány prekurzory pro produkci monomerů mcl-PHA, 4-hydroxybutyrátu (4HB) a 3-hydroxyvylerátu (3HV). Teoretická část práce pojednává o charakteristice studovaných polymerů, jejich vlastnostech a využití, a také o termofilních organismech a jejich možnosti uplatnění v průmyslu. V experimentální části práce byly prováděny kultivace s různými prekurzory, u kterých se měnily časy přidání a koncentrace. Během těchto kultivací byly použity čtyři bakteriální kmeny S. thermodepolymerans pocházející z různých veřejných sbírek mikroorganismů. Po sérii prvotních screeningů byl vyhodnocen jako nejlepší prekurzor kyselina levulová přidaná v čase zaočkování produkčního média inokulem. Následně byla provedena kultivační série koncentrační řady, kde bylo zjišťováno, zda úprava koncentrace prekurzoru ovlivní složení kopolymeru. Při zvyšování množství prekurzoru klesalo množství biomasy a PHA, avšak vznikly velmi zajímavé materiály s vysokým obsahem 3HV. Při přidání 8 g/l prekurzoru to bylo až 52 %. Nakonec byla u vzniklých materiálů zjištěna molekulová váha polymeru pomocí gelové permeační chromatografie (SEC) s detektorem statického rozptylu světla ve více úhlech (MALS).
|
host ::
RSS.