|
|
Vývoj nové generace bioinokulantů a studium jejich biologické aktivity
Súkeník, Martin ; Pekař, Miloslav (oponent) ; Sedláček, Petr (vedoucí práce)
Cíl této diplomové práce spočíval v charakterizaci specifických mechanismů biologické aktivity u bakterií podporujících růst rostlin (PGPR), běžně se nacházející v rhizosféře rostlin a ve studii účinků aplikace kapalných i gelových PGPR bioinokulantů na rostliny v kontrolovaném prostředí. Pro přípravu gelových bioinokulantů na bázi těchto PGPR byl navržen originální koncept samo-enkapsulace prostřednictvím síťování alginátu přímo produkovaného v průběhu jejich biotechnologické kultivace. Ověření účinnosti tohoto konceptu vyžadovalo všechny vybrané kmeny podrobit gelačním experimentům se síťovacím činidlem CaCl2 2 % hm. za tvorby alginátového gelu. Pro přípravu a charakterizaci bioinokulantů byly vybrány tři konkrétní kmeny Azotobacter vinelandii DSM 87, DSM 720 a CCM 289. Materiálové vlastnosti vytvořených gelů byly charakterizovány metodou oscilační reometrie (amplitudovým testem). Všechny kmeny byly podrobeny gravimetrickému stanovení koncentrace alginátu i biomasy. Pro ověření viability buněk ihned po kultivaci byla použita průtoková cytometrie s fluorescenční sondou PI, DAPI a SYTOX™ Green. Dále bylo provedeno sušení gelů s pomocí lyofilizátoru, kdy lyofilizovaný gel byl použit při botnacích experimentech s následným sušením. V rámci ověření biologické aktivity bioinokulantů byla kvalitativně ověřena schopnost všech kmenů rozpouštět a utilizovat fosfáty z agarového živného média. Dále byla u všech kmenů spektrofotometricky ověřena produkce indol-3-octové kyseliny. Kvalitativně i kvantitativně byla ověřena také produkce sideroforů. Pěstební pilotní experimenty na rostlině lociky salátové (Lactuca sativa) byly provedeny s přídavkem kapalné i gelové nosičové PGPR kompozice, jako negativní kontrola byla rostlina ponechána bez přídavku nosičové PGPR kompozice. Výsledky z pilotního pěstebního experimentu prokázaly pozitivní růstový efekt gelové i kapalné PGPR kompozice na rostliny. Na konci pěstebního experimentu byla zaznamenána vyšší délka listů a kořenového systému po aplikaci obou forem PGPR do půdy, konkrétně průměrná délka listů s přídavkem gelové nosičové PGPR kompozice byla 4,3±1,0 cm, pro kapalnou nosičovou PGPR kompozici 4,3±1,2 cm, průměrná délka kořenového systému byla 18,3±5,2 cm respektive 17,4±6,0 cm. Hmotnost sušiny na jednu vypěstovanou rostlinu s přídavkem kapalné i gelové PGPR byla shodná, tedy 0,19±0,07 g. Nejvyšší obsah chlorofylu a, chlorofylu b i karotenoidů v listech byl spektrofotometricky prokázán u rostlin rostoucích s přídavkem kapalné PGPR kompozice, konkrétně chlorofylu a bylo zjištěno 6±1 µg/ml, chlorofylu b 7±2 µg/ml a karotenoidů 3,6±0,5 µg/ml. Pomocí destiček BIOLOG EcoPlate™ byla analyzována diverzita půdních mikrobiomů odebraných z půdy bez přídavku PGPR kompozice, s přídavkem kapalné PGPR kompozice a s přídavkem gelové PGPR kompozice. Diverzita mikrobiomu byla vyhodnocena pomocí průměrného vývoje barvy jamky, tedy parametru AWCD a pomocí Shannonova indexu diverzity H'. Nejvyšší utilizace nejširšího počtu uhlíkových zdrojů na destičce byla zaznamenána u půdního mikrobiomu s přídavkem gelové PGPR kompozice. Již zmíněný půdní mikrobiom také vykazoval nejvyšší hodnotu indexu H'.
|
|
|
Využití různých gelačních strategií při vývoji nové generace bioinokulantů
Krýslová, Jana ; Smilek, Jiří (oponent) ; Sedláček, Petr (vedoucí práce)
Tato diplomová práce se zabývá nad různými přístupy síťování bakteriálních kultur kmene Azotobacter vinelandii, která patří do skupiny PGPR a je schopná produkovat extracelulárně alginát. Cílem tohoto síťování je produkce nové generace bioinokulantů založených na tomto bakteriálním druhu. První část je věnována zkoumání vlivu kyslíku v rámci kultivace na samotnou gelaci bakteriálních kultur. Experimentálně bylo zjištěné, že bakteriální kultury v celkovém objemu 50 a 100 ml v 250 ml Erlenmayerových baňkách vykazovaly gelaci už v samotné médiu, přičemž vzniklé gely byly měřené reometricky a vykazovaly hodnoty komplexního modulu 0,026 kPa a 0,030 kPa. Při bakteriální kultuře v celkovém objemu 150 ml nedošlo k spontánnímu síťování v průběhu gelace. Kromě testování gelace byl v bakteriálních kulturách stanovený i obsah PHB a extracelulárního alginátu a jeho molekulová hmotnost metodou velikostně vylučovací chromatografie s víceúhlovým rozptylem světla (SEC-MALS) a pevnost vzniklých gelů pomocí reometrie. Síťování bakteriálních kultur probíhalo především s využitím CaCl2 jako síťovacího činidla, avšak byly otestované i alternativní způsoby gelace (prostřednictvím vícemocných iontů, slabých organických kyselin, srážedel jako DMSO, emulzní gelace). Taktéž byl otestovaný vliv glukono-D-laktonu (GDL) jako činidla indukujícího gelaci postupným uvolňováním síťovacích iontů v médiu z nerozpustné formy. Nejpevnější gely vznikaly přídavkem vícemocných iontů (pohybovaly se v hodnotě komplexního modulu 10 kPa, v případě použití slabých kyselin a DMSO se gely pohybovaly v hodnotě komplexních modulů v rozmezí 1 až 10 kPa. Přídavek GDL nevytvářel gely okamžitě, ale opožděně a došlo ke sledování gelovatění v čase. Vytvořený gel se pohyboval v hodnotě do 1 kPa.
|
|
|
Preparation, characterization layered hydrogel electrospun materials and determination of transport characteristics
Šudáková, Anna ; Kalina, Michal (oponent) ; Smilek, Jiří (vedoucí práce)
Nowadays, the effective delivery of drugs to the human body is still a big problem. It is still a matter of receiving a drug with a constant concentration that is released quickly, which could be more effective. Therefore, there was a focus on the development of a new method of drug delivery using the so-called gradual release, which would prevent the rapid release (e.g., burst effect) of a large concentration of the drug into the body. This problem is solved in this work using a composite material composed of a non-woven fabric, which functions here as a polymer carrier, which in this case, carries the dye for the release kinetics stage. The polypropylene non-woven fabric is investigated here in alginate, chitosan, and gelatine polymer solutions. The materials were studied to see if and how much the polymer itself was released from the layered material into the water environment. This was measured using the viscometry method. Subsequently, the release kinetics through materials with a different number of layers was determined using the diffusion cell method. The last part of the work focuses on the study of the release of a dye (methylene blue) from a layered material that contains a gradient of this dye.
|
|
|
Self-encapsulation of Plant Growth Promoting Rhizobacteria as a way towards new generation of bioinoculants
Gašparová, Dominika ; Obruča, Stanislav (oponent) ; Sedláček, Petr (vedoucí práce)
This bachelor thesis focuses on Plant Growth-Promoting Rhizobacteria that can be used as a suitable ecological alternative to conventional fertilizers. However, most of today's approaches to incorporating PGPR into the process of soil fertilization are convoluted and costly. Crosslinking of alginate self-produced by PGPR offers a new possibility of plantgrowth- promoting bacteria encapsulation. The aim of this thesis consists of preparing gel matrices with incorporated bacteria, followed by testing the bacteria's viability and quantity. Firstly, experiments were carried out to determine various properties of gels produced by the chosen representative bacteria Azotobacter vinelandii. These properties include the molecular weight of alginate (with the highest molecular weight of strain CCM 289 (329,78± 6,8) kDa), the alginate's amount in the gel, the content of PHB (34%-44% CDW), and the gel's overall rheological properties. The complex modulus (as a representation of rheological properties) of the firmest gel reached the value of 13,34 kPa. The bacteria content was examined by flow cytometry, the CFU method, and spectrophotometry. The viability of bacteria was determined by analyzing the fluorescence intensity via fluorescent dyes (propidium iodide, fluorescein diacetate, rhodamine 123, calcein AM), then by using the CFU method, and also via the plate method. Furthermore, the effects of various factors such as different pH levels (pH 3, 7, and 10) or adding the specific alginatedegrading enzyme alginase were also examined. Releasing of the bacteria was observed over the course of seven days using flow cytometry and the CFU method. The plate method proved the bacteria's survival after gelation and without any source of carbon. The largest disintegration of gels occurred in acidic pH. Moreover, the effect of alginase on crosslinked bacterial gels and synthetic alginate were very similar. The survival of bacterial cultures in gel and their continuous release are significant findings in the development of novel bioinoculants based on this new concept.
|
|
|
Příprava a charakterizace enzymatických krytů ran
Jurová, Bronislava ; Szotkowski, Martin (oponent) ; Skoumalová, Petra (vedoucí práce)
Tato diplomová práce je zaměřena na studium a charakterizaci nanovlákenných krytů ran z přírodních biopolymerů. Do těchto nanovlákenných krytů byly inkorporovány proteolytické enzymy, konktrétně kolagenáza a bromelain. Teoretická část se zabývá stručnou charakteristikou kožních ran, jejich hojením a kožními kryty. Také jsou zde uvedeny metody přípravy těchto krytů a metody použity k jejich charakterizaci. Praktická část se zabývá optimalizací přípravy nanovlákenných krytů na bázi polyhydroxybutyrátu, želatiny, alginátu a chitosanu. Tato nanovlákna byla poté obohacena o aktivní látky a bylo sledováno jejich postupné uvolňování do modelového prostředí. Na závěr byla u těchto látek stanovena jejich proteolytická aktivita.
|
|
|
Enkapsulace aktivních látek do nanovláken a možnosti jejich aplikace
Procházková, Lucie ; Pernicová, Iva (oponent) ; Skoumalová, Petra (vedoucí práce)
Diplomová práce byla založena na optimalizaci výroby nanovlákenných krytů a zisku produktu pro následné funkční využití. Výroba nanovlákenných krytů probíhala z vybraných materiálů metodou elektrospinning a forcespinning. Jako výchozí materiály byly použity polyhydroxybutyrát, želatina, chitosan a alginát. Tyto materiály byly po úspěšné optimalizaci obohaceny o aktivní složky ampicilin a ibuprofen pro funkcionalizované využití krytů pro účinnější hojení ran. Teoretická část byla zaměřena na problematiku kůže, procesy hojení, druhy ran a nanovlákny, dále byla zmíněna charakterizace vybraných výchozích materiálů pro formování nanovláken. Praktická část vycházela ze zdlouhavého procesu optimalizace přípravy vlákenných krytů a později i krytů obohacených o aktivní složky. Dále byly navrženy kombinované kryty z různých materiálů s obsahy obou aktivních složek. Následovala charakterizace veškerých připravených krytů z pohledu stability v krátkodobém i dlouhodobém měřítku. Stanoveno bylo postupné uvolňování aktivních složek spektrofotometricky i metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie. Důležité bylo také stanovení antimikrobiální aktivity vybraných aktivních složek enkapsulovaných do struktury krytů. Závěrem byly kombinované kryty s obsahem obou aktivních složek využity pro testování bezpečnosti s humánními buňkami typu keratinocytů (HaCaT). Testování bezpečnosti vycházelo ze stanovení viability humánních buněk pomocí MTT testu, pro ověření i LDH testu. Proveden byl také scratch test (test hojení ran) po aplikaci navržených kombinovaných krytů.
|
|
|
Příprava a charakterizace moderních krytů ran
Balášová, Patricie ; Pernicová, Iva (oponent) ; Skoumalová, Petra (vedoucí práce)
Tato diplomová práce je zaměřena na studium bioaktivních krytů ran. V průběhu práce byly připraveny hydrogelové, lyofilizované a nanovlákenné kryty ran. Hydrogelové a lyofilizované kryty ran byly připravovány na bázi dvou polysacharidů – alginátu a chitosanu. Nanovlákenné kryty ran byly připravovány zvlákněním polyhydroxybutyrátu. Veškeré připravené kryty ran byly obohaceny o bioaktivní látky, které představovaly zástupce analgetik (ibuprofen), antibiotik (ampicilin) a enzymů (kolagenáza). Do hydrogelových a lyofilizovaných krytů ran byly inkorporovány veškeré vybrané aktivní látky, zatímco nanovlákenné kryty byly připraveny pouze s ibuprofenem a ampicilinem. Teoretická část se věnuje anatomii a funkci lidské kůže. Byl zde vysvětlen proces hojení ran a představeny moderní kryty ran dostupné na trhu. Další část byla věnována materiálům na přípravu krytů ran (alginát, chitosan, polyhydroxybutyrát) a aktivním látkám, které byly využity v průběhu experimentální části této práce. V teoretické části byly přiblíženy metody příprav vlákenných krytů ran a taktéž v této práci využité metody testování cytotoxicity. První část experimentální práce byla zaměřena na přípravu již zmíněných krytů ran. U připravených krytů ran se v další části práce sledovaly jejich morfologické změny v čase a taktéž postupné uvolňování inkorporovaných aktivních látek do modelového prostředí. Postupné uvolňování ampicilinu bylo sledováno nejen spektrofotometricky, ale rovněž i pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie. V krytech, ve kterých byla zabudována kolagenáza, se sledovala i konečná proteolytická aktivita tohoto enzymu. Účinek aktivních látek byl pozorován na třech vybraných mikroorganismech: Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis a Candida glabrata. Sledován byl rovněž i cytotoxický účinek na humánní buněčnou linii keratinocytů prostřednictvím MTT testu a LDH testu. Proveden byl i test pro sledování rychlosti hojení ran – scratch test.
|
|
|
New possibilities in wound healing
Nováková, Laura ; Szotkowski, Martin (oponent) ; Skoumalová, Petra (vedoucí práce)
The diploma thesis is focused on the study of fibrous wound dressings prepared by electrospinning method from natural biopolymers. Three active ingredients were added to the dressings: ampicillin, ibuprofen and collagenase, which are responsible for relieving pain, reducing the risk of infection and selectively removing necrotic tissue in the wound. The theoretical part describes the therapeutic dressings currently available on the market and the most common methods of nanofiber production. The experimental part evaluates the optimization of the preparation of gelatin, alginate and chitosan fibrous wound dressings, which were subsequently enriched with active substances and their gradual release into the model environment was determined spectrophotometrically. Antimicrobial effects against E.coli and S. epidermidis strains andantifungal activity against C. glabrata yeast were monitored. Finally, two cytotoxicity tests on the human keratinocyte cell line HaCaT confirmed the safety of the prepared products, which can serve as bioactive skin dressings in the future.
|
|
|
Hydrogelové nosiče mikroorganismů v moderních environmentálních aplikacích
Súkeník, Martin ; Slaninová, Eva (oponent) ; Sedláček, Petr (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce se zabývá optimalizací kultivace a gelace bakterie rodu Azotobacter vinelandii patřící do skupiny PGPR, která je schopná syntetizovat intracelulární polyhydroxyalkanoáty a extracelulární alginát. Bakterií produkovaný alginát je síťován pomocí roztoku chloridu vápenatého za vzniku hydrogelového nosiče obsahující zmíněnou bakterii. Tento nekonvenční koncept enkapsulace bakterií přináší zjednodušení procesu výroby hydrogelových nosičů a širší uplatnění v moderních environmentálních aplikacích. V první části práce byly vybrány tři kmeny (DSM 85, 87 a 720), při kterých byla gravimetricky stanovena koncentrace produkovaného alginátu, jeho molekulová hmotnost byla určena technikou SEC-MALS a poměr M/G podjednotek byl analyzován technikou infračervené spektroskopie. Kmen Azotobacter vinelandii DSM 87 dosáhl při gravimetrickém stanovení nejvyšší koncentraci alginátu (4,9 ± 0,6) g/l v 5. den kultivace. Koncentrace produkovaného PHB se pohybovala v rozmezí 6 až 48 % CDW, která byla určena metodou plynové chromatografie. Nicméně nejlepší gelační vlastnosti vykazoval kmen DSM 720, který byl v druhé části práce použit na podrobnější optimalizaci kultivačních podmínek, a dále na analýzu tvorby gelů při rozdílné teplotě, čase gelovatění a různé koncentraci síťovacího činidla. Vytvořené gely byly porovnané reologickým měřením pomocí amplitudového a frekvenčního testu.
|
|
|
Mechanické a transportní vlastnosti hybridních hydrogelových systémů
Klímová, Eliška ; Sedláček, Petr (oponent) ; Kalina, Michal (vedoucí práce)
Tato diplomová práce se zabývá studiem mechanických a transportních vlastností hybridních hydrogelových systémů. Vzhledem k aplikacím hydrogelů, zejména v oblasti chemického průmyslu, farmacie či medicínských aplikací, byly pro studium vybrány hydrogely na bázi gellanu a alginátu sodného. Pro porovnání jednotlivých vlastností byly připraveny jak fyzikální, tak hybridní hydrogely. Gellanové hydrogely byly připraveny v prostředí deionizované vody, dihydrátu chloridu vápenatého a tweenu 80. Alginátové hydrogely byly připraveny v prostředí dihydrátu chloridu vápenatého a polyakrylamidu s N,N´–methylenbisakrylamidem. Pro studium mechanických vlastností byly vybrány sušící váhy a reologická měření. Transportní vlastnosti byly zkoumány difúzními experimenty v kombinaci s UV-VIS spektroskopickou detekcí. Závěrem této práce je sumarizace naměřených hodnot pro poskytnutí uceleného přehledu na tuto problematiku. Bylo zjištěno, že při vhodně zvolených koncentracích strukturních komponent hydrogelové sítě i jednotlivých aditiv, lze ovlivňovat mechanické i transportní vlastnosti studovaných hydrogelů.
|
host ::
RSS.