|
|
Vlastnosti expresních vektorů pro Corynebacterium glutamicum a jejich využití při studiu faktorů sigma RNA polymerasy
Dvořáková, Pavla ; Pátek, Miroslav (vedoucí práce) ; Konopásek, Ivo (oponent)
Cílem práce bylo charakterizovat vybrané expresní vektory pro biotechnologicky významný bakteriální druh, Corynebacterium glutamicum, a testovat možnosti jejich využití při studiu řízení aktivity promotorů faktory sigma RNA polymerasy. Měřením míry exprese modelového genu gfpuv stanovením intenzity fluorescence produkovaného proteinu a použitím analýzy populace buněk C. glutamicum exprimujících gen gfpuv pomocí průtokové cytometrie byly u studovaných vektorů zjištěny odlišné vlastnosti: míra exprese klonovaného genu, bazální hladina exprese bez induktoru, závislost míry exprese na koncentraci induktoru a stupeň homogenity buněk z hlediska exprese genu gfpuv. Pro testování biplasmidového systému pro přiřazení faktoru sigma k vybranému promotoru byl zvolen vektor pEC-XT99A, který sice neměl vysokou účinnost exprese, ale nevykazoval bazální expresi, exprese byla srovnatelná v širší škále koncentrací induktoru IPTG a buněčná populace byla z hlediska exprese modelového genu zcela homogenní. S využitím vektoru pEC-XT99A, který exprimoval jednotlivé geny pro stresové faktory sigma, byl dosud neznámému promotoru Pcg0420 jednoznačně přiřazen faktor σD , který řídil jeho funkci. Další vektor, určený pro izolaci a purifikaci proteinů z C. glutamicum, umožnil expresi genu sigM z C. glutamicum a izolaci proteinu σM...
|
|
|
Účast alternativních sigma faktorů RNA polymerasy při regulaci exprese genů Corynebacterium glutamicum
Šilar, Radoslav ; Nešvera, Jan (vedoucí práce) ; Branny, Pavel (oponent) ; Lichá, Irena (oponent)
Abstrakt Regulace transkripce sigma faktory RNA polymerasy s extracytoplazmatickou funkcí (ECF) představuje velmi účinný nástroj pro adaptaci buňky na stresové podmínky vyvolané změnami ve vnějším prostředí. Gram-pozitivní, aerobní bakterie Corynebacterium glutamicum je významným producentem aminokyselin. V genomu C. glutamicum se nachází 7 genů kódujících sigma faktory: primární sigma faktor SigA, sigma faktor SigB označovaný jako primary-like sigma faktor a 5 ECF sigma faktorů (SigC, SigD, SigE, SigH a SigM). Gen sigH, kódující sigma faktor SigH se nachází v těsné blízkosti genu rshA kódujícího jeho anti-sigma faktor. Anti-sigma faktory se reverzibilně vážou k příslušným sigma faktorům, čímž blokují jejich aktivitu. Za stresových podmínek je vazba mezi oběma proteiny rozrušena a uvolněný sigma faktor se může vázat k jádru RNA polymerasy a aktivovat iniciaci transkripce. V práci byla studována především regulace exprese genů kódujících nejvýznamnější ECF sigma faktor SigH a jeho anti-sigma faktor RshA a geny patřící k jeho regulonu. Transkripční analýzou operonu sigH-rshA byly identifikovány čtyři vegetativní promotory genu sigH a jeden SigH-dependentní promotor genu rshA. Účast komplexu SigH-RshA na regulaci exprese genů byla zkoumána s použitím delečního kmene C. glutamicum ΔrshA. Metodou DNA...
|
|
|
Funkce sigma faktorů RNA polymerasy v Corynebacterium glutamicum
Dvořáková, Pavla ; Pátek, Miroslav (vedoucí práce) ; Dvořáček, Lukáš (oponent)
Cílem této práce bylo charakterizovat funkce sigma faktorů bakterie Corynebacterium glutamicum a analyzovat sekvence promotorů rozeznávaných jednotlivými sigma faktory. Faktory sigma (σ) jsou podjednotky RNA polymerasy, které zajišťují rozpoznání sekvence specifické promotorové oblasti genu a umožňují tak zahájit jeho transkripci. Genom C. glutamicum nese geny, které kódují primární sigma faktor σA a šest alternativních sigma faktorů, σB , σC , σD , σE , σH a σM , jejichž exprese se mění v závislosti na růstových podmínkách a v reakci na podněty z okolního prostředí. Regulace exprese genů na úrovni transkripce je jedním z mechanismů adaptace buňky na změny životních podmínek. V závěru práce je sestavena regulační síť sigma faktorů, která je jádrem komplexní regulační sítě řídící všechny děje v buňce C. glutamicum. Klíčová slova: sigma faktor (SF), RNA polymerasa, Corynebacterium glutamicum, transkripce, promotor
|
|
|
Role of promoter in the regulation of alternative splicing
Kozáková, Eva ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Půta, František (oponent) ; Blažek, Dalibor (oponent)
Bylo ukázáno, že až 95 % genů obsahujích více než dva exony, podstupuje alternativní sestřih. Regulace alternativního sestřihu je velmi složitý proces. Většina intronů je odstraněna z pre- mRNA během transkripce a přibývá důkazů, které poukazují na důležitost chromatinových modifikací v regulaci alternativního sestřihu. V této práci ukazujeme, že inhibice histonových deacetyláz (HDACs), která způsobuje zvýšení acetylace histonů a zrychlení elongace Pol II, ovlivňuje alternativní sestřih přibližně 700 genů. Identifikovali jsme HDAC1, jejíž enzymatická aktivita je zodpovědná za změny v alternativním sestřihu. Poté jsme se zaměřili na Brd2 protein, který váže acetylované histony a ovlivňuje alternativní setřih ~ 300 genů. Dále jsme ukázali, že se Brd2 protein váže na promotory genů, které ovlivňuje. Dále jsme zjistili, že deplece histonacetyltransferázy p300 podporuje zahrnutí alternativního EDB exonu fibronektinového genu (FN1) v mRNA. Asociace p300 proteinu s CRE místy v promotoru je zprostředkována interakcí s CREB transkripčním faktorem. Vytvořili jsme sestřihové reportéry pod kontrolou arteficiálních promotorů obsahující CRE místa. Delece i mutace CRE míst v promotoru ovlivnila alternativní sestřih EDB exonu stejně jako deplece p300 proteinu. Poté jsme ukázali, že deplece p300 snižuje acetylaci...
|
|
|
Regulace genové exprese u anaerobních parazitických protist a využití poznatků v praxi
Brzoň, Ondřej ; Zubáčová, Zuzana (vedoucí práce) ; Horváthová, Lenka (oponent)
Vzhledem ke svému významu pro každou buňku je dnes regulace genové exprese často studovaná na všech svých úrovních. Na druhou stranu, informace o regulaci genové exprese u protist jsou prozatím omezeny prakticky pouze na několik modelových organismů. Z anaerobních protist se jedná zejména o tři druhy parazitující u člověka: Trichomonas vaginalis, Entamoeba histolytica a Giardia intestinalis. Teprve v poslední době se výzkum rozšířil i na některé další organismy (např. Entamoeba invadens nebo některé druhy rodu Spironucleus). Tato práce se zabývá regulací genové exprese na úrovni struktury promotorových oblastí genů kódujících proteiny a využitím těchto poznatků při konstrukci transfekčních systémů, které jsou jedním z nejefektivnějších a nejsilnějších nástrojů studia molekulární a buněčné biologie.
|
|
|
Financování vzdělávání žáků se zdravotním postižením ve středních školách
Filip, Josef ; Krutská, Dagmar (vedoucí práce) ; Svoboda, Petr (oponent)
Diplomová práce se zabývá problematikou financování vzdělávání žáků se zdravotním postižením ve středních školách. Cílem práce je vytvořit ucelený přehled o vzdělávání žáků se zdravotním postižením, porovnat a analyzovat normativní financování nejrozšířenějšího oboru vzdělání u těchto žáků podle krajů. Teoretická část obsahuje národní vzdělávací koncepce a programy se zaměřením na handicapované žáky. Vedle podrobné charakteristiky jednotlivých druhů zdravotního postižení je zde také popsáno institucionální vzdělávání a normativní financování žáků s handicapem. Ve výzkumné části jsou analyzovány výkazy MŠMT o žácích se zdravotním postižením. Tabulky a grafy obsahují údaje o žácích v České republice podle druhu postižení, o počtech žáků ve speciálních třídách a integrovaných žácích v letech 2007 - 2012. Nedílnou součástí výzkumu je přehled o vzdělávání žáků podle zřizovatelů škol. Na závěr výzkumu je podrobné porovnání normativního financování nejrozšířenějšího oboru vzdělání 65-51-E/01 Stravovací a ubytovací služby především pro žáky s mentálním postižením a žáky s vývojovými poruchami učení a chování.
|
|
|
Regulatory mechanisms of ornithin transcarbamylase and beta-glucocerebrosidase gene expression and their relevance to diagnostics
Lukšan, Ondřej ; Jirsa, Milan (vedoucí práce) ; Kožich, Viktor (oponent) ; Kříž, Vítězslav (oponent)
4 Abstrakt Konečná diagnóza d dičných metabolických poruch je obvykle určena na základ vyšet ení enzymové aktivity (což je mnohdy komplikované) a/nebo za pomoci molekulárn genetického vyšet ení. Výsledky standardní mutační analýzy však mohou být n kdy zavád jící, zejména v p ípad rozsáhlých reorganizací na úrovni chromozomu či u mutací v regulačních oblastech. P edkládaná práce je zam ena na charakterizaci komplexních mutací v genu pro ornitin transkarbamylázu (OTC), studium regulačních oblastí OTC a genu pro β-galaktozidázu (GBA). V rámci studie provedené na souboru čítajícím 37 pacient s kongenitální hyperamonémií II. typu (OTCD) bylo identifikováno a charakterizováno 14 nových mutací včetn t í rozsáhlých delecí. Byl zaznamenán i p ípad symptomatické heterozygotky pro hypomorfní mutaci p.R129H, u níž byl fenotyp OTCD z ejm podmín n posunem v X-inaktivaci ve prosp ch mutované alely. Nález byl podložen sledováním nevýhodné X-inaktivace ve t ech r zných periferních tkáních. Za účelem prov ení patogenity promotorové variace c.-366A>G v OTC nalezené v jedné rodin s mírným fenotypem OTCD byly identifikovány t i alternativní počátky transkripce (PT) a vymezen promotor lidského OTC. Transkripční aktivita promotoru, stejn tak jako aktivita nov nalezeného distálního enhanceru, byla ov ena funkční esejí. Výsledky...
|
|
|
Charakterizace promotorových oblastí genů HGSNAT a GBA, a příspěvek ke studiu patogeneze MPS IIIC a Gaucherovy choroby
Richtrová, Eva ; Hřebíček, Martin (vedoucí práce) ; Macek, Milan (oponent) ; Adam, Tomáš (oponent)
Patogeneze mukopolysacharidózy IIIC (MPS IIIC) a Gaucherovy choroby nebyla na molekulární úrovni doposud zcela objasněna, stejně jako nejsou známy důvody pro výrazně rozdílné fenotypové projevy u pacientů nesoucích stejný genotyp. Protože varianty v regulačních oblastech genů mohou být příčinou výše zmíněné fenotypové variability, zabývala jsem se studiem doposud necharakterizovaných promotorových oblastí genů HGSNAT a GBA, které jsou mutovány u těchto dvou lysosomálních onemocnění. Prokázala jsem existenci alternativního promotoru genu GBA (P2) a dále se zabývala studiemi, které by mohly objasnit jeho fyziologickou funkci a případně i roli při patogenezi Gaucherovy choroby. Zjistila jsem, že alternativní promotor genu GBA není tkáňově specifický a nevede k variabilní expresi mRNA pro glukocerebrosidázu u pacientů se stejným genotypem a výrazně odlišnými fenotypovými projevy. P2 není různě využíván během diferenciace monocytů na makrofágy, ani u makrofágů odvozených od kontrolních osob a od pacientů s Gaucherovou chorobou, u kterých je střádání přítomno hlavně v buňkách makrofágového původu. Nepodařilo se tedy nalézt změny svědčící pro možnou úlohu P2 v patogenezi nemoci. Dále jsem charakterizovala promotorovou oblast genu HGSNAT a prokázala jsem, že vazba transkripčního faktoru Sp1 je důležitá pro...
|
|
|
Regulation of transcription in mycobacteria.
Páleníková, Petra ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Mrvová, Silvia (oponent)
Bakteriálna bunka sa musí vedieť rýchlo prispôsobiť zmenám, ktorým je vystavená v prostredí. Na tieto zmeny reaguje reguláciou génovej expresie primárne na úrovni iniciácie transkripcie. Medzi formy reguláciu transkripcie môžeme zaradiť rôznu stavbu promótorových oblastí pred odlišnými skupinami génov, prítomnosť alternatívnych sigma faktorov a tiež ovplyvňovanie priebehu génovej expresie pôsobením transkripčných faktorov buď ako aktivátory, alebo ako inhibítory. V tejto práci sú popísané spôsoby regulácie transkripcie u baktérií rodu Mycobacterium, ku ktorým zahrňujeme aj patogénne baktérie M. tuberculosis a M. leprae. Baktérie tohto rodu vykazujú malú konzervovanosť promótorových oblastí, veľké množstvo sigma faktorov, veľký počet transkripčných faktorov, prítomnosť dvojkomponentových systémov a mnoho, zatiaľ málo preskúmaných, malých regulačných RNA.
|
|
|
Exprese genů pro konverzi nitrilů a amidů v Rhodococcus erythropolis
Kracík, Martin ; Pátek, Miroslav (vedoucí práce) ; Mikušová, Gabriela (oponent)
Kmen Rhodococcus erythropolis A4 je zdrojem enzymů nitrilhydratázy a amidázy katalyzujících konverze nitrilů a amidů. Tyto enzymy jsou používány při průmyslových biotransformacích a bioremediacích. Vzhledem k tomu, že genové manipulace vedoucí ke zvýšení produkce těchto enzymů bylo v kmeni A4 obtížné provést, byly v této práci identifikovány a analyzovány příslušné geny (ami a nha1+nha2) v příbuzném kmeni R. erythropolis CCM2595, v kterém lze manipulace s plazmidy i v chromozomu rutinně provádět. Geny ami a nha1+nha2 z kmene R. erythropolis CCM2595 byly izolovány a společně se sousedícími oblastmi (celkem 5,5 kb) sekvenovány. Byla zjištěna organizace těchto genů a předpokládaných regulačních genů v kmeni CCM2595 a zkoumán způsob regulace exprese těchto genů. Pro analýzu transkripce genů pro amidázu a nitrilhydratázu z obou kmenů R. erythropolis byl použit promoter-probe vektor pEPR1 replikující se v Escherichia coli a R. erythropolis, v němž byly zkonstruovány transkripční fúze promotorů Pami z kmene A4 i CCM2595 a reportérového genu gfp. Aktivita promotorů Pami byla měřena prostřednictvím fluorescence produktu genu gfp, zeleného fluoreskujícího proteinu. Měření fluorescence buněk nesoucích vektor pEPR1 s promotory genů ami z obou zkoumaných kmenů prokázalo, že jejich aktivita je převážně konstitutivní a...
|
host ::
RSS.