|
|
Meiotic homologous recombination and hybrid sterility
Gergelits, Václav ; Forejt, Jiří (vedoucí práce) ; Macholán, Miloš (oponent) ; Munclinger, Pavel (oponent)
(česky) Meiotická homologní rekombinace, synapse homologních chromosomů a hybridní sterilita F1 kříženců jsou vzájemně provázané fenomény závisející jeden na druhém. V předložené dizertační práci jsme tyto fenomény zkoumali na genetické i mechanistické úrovni za využití modelu myších poddruhů. Identifikovali a charakterizovali jsme noncrossovery (NCO, též genové konverze), které zprostředkovávají 90% všech oprav meiotických dvouřetězcových zlomů (DSB), determinovaných genem Prdm9, a to na celochromosomální úrovni. Na základě 94 detekovaných NCO jsme spočítali střední délku doprovodných úseků genové konverze jako 32 bp. Na lokální úrovni se NCO překrývaly s již známými hotspoty trimethylovaných histonů a utváření DSB. Lokalizace hotspotů v genomu je určená proteinem PRDM9. Z toho vyplývá, že NCO skutečně mají původ ve standardní dráze opravy meiotických DSB. Na celochromosomální úrovni jsme pozorovali rozdílné distribuce NCO a crossoverů (CO), projevující se zejména relativní preferencí CO před NCO v subtelomerických oblastech. Pozorovali jsme deficit specifické třídy tzv. nonparentálních, či asymetrických NCO a CO. Navrhujeme, že tyto NCO a CO jsou obtížně orpavitelné a hypoteticky by mohly být opraveny sesterskou chromatidou. Takováto oprava by nepřispěla k nezbytné homologní synapsi....
|
|
|
Molekulárně biologická analýza feochromocytomu a paragangliomu.
Musil, Zdeněk ; Hirschfeldová, Kateřina (vedoucí práce) ; Zamrazilová, Hana (oponent) ; Uhrová Mészárosová, Anna (oponent)
Předkládaná práce shrnuje výsledky výzkumu, který se zabývá relativně vzácnými neuroendokrinními nádory - feochromocytomem a paragangliomem (PHEO/PGL). Tyto nádory mohou vznikat díky dědičné genetické predispozici. Zpočátku své práce jsem se proto zaměřil na genetické vyšetření pacientů s PHEO/PGL. Byly zavedeny metody denaturační gradientové gelové elektroforézy, sekvenování dle Sangera, multiplex ligation probe amplification pro diagnostiku změn nejdříve v genech SDHD, SDHB a RET. Postupně se rozšiřoval (a stále i rozšiřuje) počet vyšetřovaných genů. V současné době metodou next generation sequencing vyšetřujeme následující geny: ATRX, BRAF, CDH1, CDKN2A, CDKN2B, FGFR1, FH, FHIT, GNAS, HIF2A (EPAS1), H-RAS, IDH1, IDH2, KIF1Bß, KMT2D, K-RAS, MAML3, MAX, MDH2, MET, NF1, NGFR, N-RAS, PHD2/EGLN1, RET, SDHA, SDHAF2, SDHB, SDHC, SDHD, TERT, TMEM 127, TP53 a VHL. Výskyt genových variant v uvedených genech (23%) se u českých pacientů s FEO/PGL se liší v porovnání s některými zahraničními studiemi (27%, 40%). Takovéto rozmezí může být způsobeno geografickými rozdíly nebo výběrem pacientů. PHEO/PGL se většinou (75%) vyskytují v benigní formě. Pro maligní formu onemocnění svědčí výskyt chromafinní tkáně v místech, kde se obvykle nenalézá, jako jsou např. játra, plíce či kosti. V testovaném souboru pacientů jsme se...
|
|
|
Analýza kvantitativních a kvalitativních genetických znaků v patogenezi hereditárních forem solidních nádorů.
Zemánková, Petra ; Kleibl, Zdeněk (vedoucí práce) ; Živný, Jan (oponent) ; Tichý, Boris (oponent)
Nádorová onemocnění patří mezi druhou nejčastější příčinu úmrtí v ČR. Nosiči mutací v genech predisponujících k dědičné formě onemocnění tvoří malou, ale klinicky velmi významnou skupinu vysoce rizikových osob. V současné době jsou známy desítky predispozičních genů pro vznik hereditárních nádorových syndromů, pro jejichž analýzu se cílené sekvenování nové generace (NGS) stalo metodou první volby. NGS umožňuje rapidní zrychlení určení příčinné mutace v oblasti diagnostiky hereditárních nádorových syndromů. K identifikaci mutací v genech predisponujících ke vzniku dědičných nádorových onemocnění jsme navrhli analýzu pomocí panelového NGS včetně bioinformatického zpracování, které umožňuje spolehlivou identifikaci jednonukleotidových záměn, krátkých inzercí/delecí i rozsáhlých intragenových přestaveb. Bioinformatické postupy, popsané v této dizertační práci, jsme následně využili k validaci panelového NGS, ale i pro identifikaci alterací v konkrétních genech, která umožnila nalézt jejich doposud nepopsané asociace s dědičnými nádorovými onemocněními. Bioinformatické analýzy se staly základem pro jednotné zpracování rozsáhlých souborů dat z CZECANCA konsorcia a umožňují konstrukci frekvenční databáze variant, která slouží pro zlepšení klinické diagnostiky nádorové predispozice u pacientů v ČR....
|
|
|
Vznik a genetická podstata glykopeptidové rezistence u koaguláza-negativních stafylokoků
Prášilová, Jana ; Balíková Novotná, Gabriela (vedoucí práce) ; Lišková, Petra (oponent)
Glykopeptidová antibiotika jsou tzv. antibiotika poslední volby, v klinické praxi využívaná k léčbě těžších, převážně nozokomiálních infekcí vyvolaných multirezistentními koaguláza-negativními stafylokoky. Vznik a genetická podstata rezistence ke glykopeptidovým antibiotikům nebyla u koaguláza-negativních stafylokoků doposud objasněna. Výzkumy prováděné u Staphylococcus aureus prokázaly, že střední rezistence ke glykopeptidovým antibiotikům je spojena s přítomností jedné či více mutací, spíše než by byla podmíněna nosičstvím konkrétního genetického elementu, jako je tomu u enterokoků. Různými druhy selekce rezistentních mutant in vitro byly získávány izogenní páry glykopeptid citlivých a rezistentních kmenů Staphylococcus epidermidis a Staphylococcus haemolyticus. Analýzou sekvencí genomů těchto dvojic byly následně identifikovány jedno nukleotidové polymorfismy, které se nacházely převážně v systémech řídících metabolismus a regulaci buněčné stěny. Fenotypová analýza neodhalila přímé spojení glykopeptidové rezistence se zvýšenou tvorbou biofilmu. V klinické praxi je problematický vznik zkřížené rezistence glykopeptidových a jiných antibiotik. U neglykopeptidových antibiotik imipenemu a rifampicinu byl již dříve popsán výskyt zkřížené rezistence s glykopeptidovými antibiotiky u S. aureus. Selekcí...
|
|
|
Současné přístupy celogenomového sekvenování a de novo sestavení genomu
Halenková, Zuzana ; Reifová, Radka (vedoucí práce) ; Röslein, Jan (oponent)
Během uplynulých deseti let klesla díky vývoji sekvenátorů druhé a třetí generace cena sekvenování téměř desettisíckrát. Osekvenování a sestavení celogenomové sekvence organismu je tak čím dál tím dostupnějším nástrojem a může najít využití v mnoha vědních oborech. Na cestě za kompletní sekvencí DNA organismu je nutné učinit několik rozhodnutí, která jsou stěžejní pro úspěšné sestavení kvalitní celogenomové sekvence. Tato rozhodnutí se týkají přípravy vzorků, výběru metody sekvenování a stanovení vhodného přístupu k sestavení sekvence. Bakalářská práce popisuje různé metody, které lze pro jednotlivé části procesu zvolit, a aspekty, které je nutné při rozhodování zohlednit. Klíčová slova: sekvenování nové generace, sekvenování třetí generace, celogenomové sekvenování, de novo sestavení genomu, algoritmy genomového sestavení
|
|
|
Paralelní detekce virových agens v patogenezi autoimunitních onemocnění
Kunteová, Kateřina ; Cinek, Ondřej (vedoucí práce) ; Saláková, Martina (oponent)
S celkovým rozvojem metod molekulární genetiky v průběhu let vznikly i nové metody, které lze využít ve virologii. Stále více je využíváno sekvenování nové generace, které umožňuje současně paralelní sekvenaci mnoha vzorků, navíc také umožní rozlišit infekci více virovými typy ve vzorku. Cílem práce bylo vyvinout metodu, kterou by bylo možné genotypizovat všechny známé typy lidských adenovirů, lidských enterovirů, a bakteriofágů, vybraných pro jejich výskyt ve střevě. Metoda využívá sekvenování nové generace. Prvním krokem při vývoji metody byl návrh primerů, které jsou schopny detekovat všechny známé typy zmíněných virů, pokrývající oblast, která je schopná tyto viry mezi sebou odlišit. Tato metoda byla testována na souboru 47 vzorků lidských adenovirů a 30 vzorků lidských enterovirů se známým sérotypem. Vytvořeny byly také vzorky se dvěma sérotypy v různém poměru. Po amplifikaci cílových částí genomu byly vzorky přečištěny a sekvenovány na přístroji MiSeq, Illumina. Metoda byla dále využita při typizování adenovirů, enterovirů a bakteriofágů v pre-diabetických kohortách DIPP, MIDIA a v kohortě diabetiků z afrických a asijských zemí. Výchozím vzorkem byla RNA/ DNA izolovaná ze vzorku stolice. Prokázali jsme, že metoda dokáže zachytit všechny testované typy virů, včetně vzorků směsných infekcí...
|
|
|
Sequence variety of HNF1B gene in autosomal recessive polycystic kidney disease
Kavec, Miriam ; Štekrová, Jitka (vedoucí práce) ; Schierová, Michaela (oponent)
Autozomálně recesivní polycystická choroba ledvin (ARPKD) je poměrně vzácné závažné dědičné onemocnění, které se projevuje cystickým postižením ledvin, dědičnou jaterní fibrózou a dilatací žlučových cest. Spektrum klinických projevů tohoto onemocnění je velmi variabilní a závisí na věku, ve kterém se onemocnění projevilo. Při těžkých formách onemocnění je možné detekovat první příznaky prenatálně okolo 20. týdne těhotenství díky zvětšeným echogenickým ledvinám a přítomnosti oligohydramnia. Kauzálním genem tohoto onemocnění je gen PKHD1, jehož proteinový produkt fibrocystin se pravděpodobně podílí na udržování intracelulární koncentrace Ca2+ kationtů. Přesný mechanizmus ARPKD patofyziologie není známý. Fenotypové projevy tohoto onemocnění se mohou překrývat s mutacemi asociovanými s jinými geny. Jedním z genů napodobujících fenotyp ARPKD je gen HNF1B. Mutace v genu HNF1B jsou nejčastější monogenní příčinou vývojových abnormalit ledvin. HNF1B je tkáňově specifický transkripční faktor, který reguluje expresi PKHD1. V praktické části jsem se zabývala genetickou analýzou HNF1B genu u 28 pacientů, u kterých nebyla potvrzena ARPKD diagnóza detekováním dvou PKHD1 mutací. Pro účely mutačního skríningu jsem používala přímého sekvenování, NGS techniky pyrosekvenování a MLPA metodu k detekci rozsáhlých delecí...
|
|
|
Vliv mikrobiomu na patogenezi střevních onemocnění
Galanová, Natalie ; Kolařík, Miroslav (vedoucí práce) ; Hudcovic, Tomáš (oponent)
Střevní mikrobiota je významným faktorem ve vývoji některých onemocnění, k nimž patří i idiopatické střevní záněty (IBD, n = 127), Ulcerózní kolitida, Crohnova choroba, a kolorektální karcinom (CRC, n = 64). Součástí této práce je připravit klinický materiál různého typu (stolice, biopsie) k sekvenaci na platformě Illumina Miseq. Tohoto je dosaženo přes izolaci DNA, amplifikaci 16S a vnitřního přepisovaného mezerníku (ITS), normlaizaci a ligaci sekvenačních adaptorů. Cílem je pomcí sekvenačních dat popsat rozdíly v mikrobiomu zdravých a nemocných jedinců v případě IBD nebo zdravé a karcinomem zasažené tkáně u pacientů s CRC. Tuto práci tvoří i kultivační část, kdy jsou vzorky čerstvé stolice (n = 3) kultivovány při široké škále aplikovaných podmínek, jimiž je zjištěna ekofyziologická a druhová diverzita těchto vzorků klasickými a molekulárními metodami. Zároveň je spolehlivě taxonomicky určena diverzita kultivovatelných hub ve fekálních vzorcích amplifikací relevantních genů (ITS1, β tubulin, druhé největší podjednotky RNA polymerázy II., RPB2) a následnou oboustrannou sekvenací Sangerovou metodou. Vybrané druhy hub jsou zpracovány na lyzáty, kterými jsou stimulovány buněčné kultury myších makrofágů (RAW). Vliv hub na imunitní odpověď je tak studován in vitro a analyzován imunologickými metodami...
|
|
|
Mutační a substituční tempo u sexuálních a klonáních forem: možné klíč k vysvětlení persistence sexu u modelové skupiny sekavců?
Röslein, Jan ; Janko, Karel (vedoucí práce) ; Rothová, Olga (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Studijní program: Molekulární biologie, genetika a virologie Bc. Jan Röslein Mutační a substituční tempo u sexuálních a klonáních forem: možný klíč k vysvětlení persistence sexu u modelové skupiny sekavců Mutation AND substitution rates in sexual and asexual forms: a clue to the persistence of sex in a model group of Cobitis? Typ závěrečné práce Diplomová Vedoucí závěrečné práce: Mgr. Karel Janko, Ph.D. Praha, 2015 Velký dík náleží mému školiteli Mgr. Karlu Jankovi, Ph.D. za velmi nápomocné, direktivní vedení práce. Též bych rád poděkoval panu Mgr. Janu Pačesovi, Ph.D. za více než vzdělávací rozměr v oblasti bioinformatické analýzy a Mgr. Ladislavu Pekárikovi, Ph.D., Mgr. Janu Kočímu za pomoc při analýze vybraných kapitol. Také bych rád poděkoval rodině za podporu. Všem participantům na této diplomové práci se hluboce omlouvám za způsobenou psychickou újmu. Prohlášení: Prohlašuji, že jsem závěrečnou práci zpracoval/a samostatně a že jsem uvedl/a všechny použité informační zdroje a literaturu. Tato práce ani její podstatná část nebyla předložena k získání jiného nebo stejného akademického titulu. V Praze dne 12. 8. 2015 Podpis: Abstrakt Klíčová slova: Abstract Key words: Obsah 1...
|
|
|
Význam somatických mutací u chronické lymfatické leukémie
Tauchmanová, Petra ; Savvulidi Vargová, Karina (vedoucí práce) ; Javorková, Eliška (oponent)
Chronická lymfatická leukémie (CLL) je považována za nejčastěji se vyskytující leukemické onemocnění v Evropě a USA, postihující převážně osoby vyššího věku (median, 70 let). Jedná se o lymfoproliferativní onemocnění charakteristické akumulací maturovaných B-lymfocytů v krvi, kostní dřeni a lymfatických uzlinách. CLL buňky mají delší dobu přežití než zdravé B-lymfocyty v důsledku porušené regulace buněčného cyklu a apoptotické dráhy. Při onemocnění CLL je možné v leukemických buňkách detekovat velké množství chromozomálních aberací a genetických abnormalit. Díky rozšíření metod sekvenování nové generace (next generation sequencing, NGS) bylo objeveno mnoho somatických mutací vyskytujících se v buňkách CLL. Analýza somatických mutací u CLL napomáhá k detailnějšímu pochopení molekulární podstaty onemocnění a otevírá nové možnosti pro případnou personalizovanou léčbu. Hlavním předmětem této práce je krátká charakteristika onemocnění a shrnutí poznatků z recentních sekvenačních studií u B-lymfocytární chronické lymfatické leukémie.
|
host ::
RSS.