|
|
Možné přístupy ke genové terapii Cystické fibrosy
Král, Jan ; Bořek Dohalská, Lucie (vedoucí práce) ; Vaněk, Ondřej (oponent)
1 Abstrakt Cystická fibróza je autosomálně recesivní onemocnění způsobené mutací v CFTR genu, která má za následek nefunkčnost či absenci CFTR chloridového kanálu. Jeden ze způsobů, jak indukovat tvorbu CFTR proteinu v postižených buňkách, představuje genová terapie. V rámci genové terapie lze do cílových buněk přenášet buď DNA, nebo mRNA. Tato práce byla zaměřena na optimalizaci metody detekce CFTR proteinu pomocí metody Western blot, díky níž byla studována účinnost přenosu CFTR-mRNA do buněčných linií. CFTR protein byl detekován v buněčné linii zdravého plicního epitelu (NuLi-1), plicního epitelu postiženého cystickou fibrózou s mutací ΔF508 (CuFi-1) a v buněčné linii plicního karcinomu (A549). Byla porovnávána účinnost čtyř způsobů buněčné lyze - lyze pomocí ultrazvuku a lyze třemi různými lyzačními pufry. Jako nejúčinnější pro detekci tohoto proteinu se ukázala lyze RIPA pufrem s inhibitory proteas. Zároveň byly porovnávány tři primární monoklonální protilátky pro detekci CFTR proteinu metodou Western blot. Z těchto protilátek se ukázala jako nejvhodnější protilátka CF3, která je specifická proti extracelulárnímu epitopu CFTR proteinu. Byly detekovány různě glykosylované formy CFTR proteinu. Největší množství CFTR protein bylo zjištěno v buněčné linii NuLi-1. Zároveň byl tento protein detekován v...
|
|
|
Exprese inhibičního faktoru migrace makrofágů u neuroblastomových buněčných linií
Polatová, Daniela ; Poljaková, Jitka (vedoucí práce) ; Groh, Tomáš (oponent)
Inhibiční faktor migrace makrofágů (MIF) je cytokin, který se přímo účastní imunitních reakcí organismu vyvolaných vnějším podnětem, např. lipopolysacharidy bakterií nebo glukokortikoidy. Na základě stimulace těmito látkami je MIF uvolňován z makrofágů. Sám aktivuje další makrofágy a T-lymfocyty a umožňuje tak uvolnění protizánětlivých cytokinů. Podílí se též na angiogenezi, neboť endogenně produkovaný MIF je naprosto nezbytný pro proliferaci endoteliálních buněk. K tvorbě nových cév stimulované MIF dochází i u nádorů, což vede k jejich růstu. Přirozeným receptorem pro MIF je integrální membránový protein CD74, který může být vystaven na povrchu buněk. Pokud je vystaven na povrchu T-lymfocytů, může být modifikován chondroitin- sulfátem a interagovat s proteinem CD44, což je důležité k efektivní aktivaci T-buněk. Na komplex CD74-CD44 se poté váže MIF. V rámci této bakalářské práce byla studována přítomnost CD74 v lidských neuroblastomových buněčných liniích UKF-NB-3 a UKF-NB-4. Elektroforézou a následnou metodou ,,Western blot" byla detekována přítomnost CD74 v linii UKF-NB-4, v linii UKF-NB-3 CD74 detekován nebyl. Přítomnost CD74 v neuroblastomových buněčných liniích indikuje, že i neuroblastomy mohou být ovlivňovány MIF. Klíčová slova: MIF, CD74, neuroblastom, tkáňové kultivace, Western blot
|
|
|
Srovnání vlastností buněčných linií rezistentních k ellipticinu, doxorubicinu a cisplatině
Černá, Tereza ; Poljaková, Jitka (vedoucí práce) ; Eckschlager, Tomáš (oponent)
6 Abstrakt Neuroblastom je nejčastější solidní extrakraniální nádor dětského věku. I přes veškeré pokroky v onkologické diagnostice a terapii je léčba některých forem neuroblastomu stále obtížná. Jednou z největších komplikací chemoterapie je vznik lékové rezistence. Tato práce se zabývá vlivem cytostatik na expresi vybraných proteinů, které se mohou podílet na chemorezistenci lidské neuroblastomové buněčné linie UKF-NB-4 na proteinové úrovni i na úrovni genové exprese. Senzitivní linie UKF-NB-4 a od ní odvozené rezistentní linie UKF-NB-4CDDP , UKF-NB-4DOXO a UKF-NB-4ELLI byly vystaveny působení cisplatiny, doxorubicinu nebo ellipticinu po dobu 24, 48 a 72 hodin. Metodou Western blot bylo prokázáno, že cytostatika cisplatina, doxorubicin nebo ellipticin podaná senzitivní neuroblastomové buněčné linii UKF-NB-4 v množstvích, která jsou přidávána do kultivačního média rezistentních neuroblastomových linií pro udržování rezistence, indukují po 72 hodinové kultivaci v této buněčné linii expresi proteinu p53 a zároveň snižují množství retinoblastomového proteinu pRb. Rozdíly v expresi proteinu RAS, cytochromů P450 1A1, 3A4 a cytochromu b5 nebyly prokázány. Změny v expresi studovaných proteinů u rezistentních linií UKF-NB-4CDDP , UKF-NB-4DOXO a UKF-NB-4ELLI kultivovaných s a bez přídavku daného cytostatika nejsou...
|
|
|
Příprava a charakterizace protilátek proti cytochromu P450 1A1
Vlasáková, Kateřina ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Mácová, Iva (oponent)
Rakovina je druhou nejčastější příčinou úmrtí v ČR. Maligní transformace buněk jsou způsobeny vznikem aduktů DNA nebo tvorbou reaktivních forem kyslíku. Jednou ze skupin enzymů, které katalyzují vznik těchto karcinogenních látek, jsou cytochromy P450, např. CYP1A1 a 1A2. V poslední době jsou velmi populární chemopreventivní doplňky stravy, které by měly snižovat riziko rakoviny. Jejich nadměrné užívání ale může vést k indukci CYP a naopak zvýšení rizika. Poznání cytochromů P450 může vést k účelnější farmakoterapii nebo dokonce prevenci rakoviny. Vhodným nástrojem pro studium proteinů je metoda "imunoblottingu", která využívá specifické vazby antigen- protilátka. K tomuto účelu mohou posloužit slepičí anti-peptidové protilátky. Výsledkem této práce bylo získání slepičích protilátek proti peptidu, který byl vybrán na základě sekvence potkaního CYP1A1 a literatury. Klíčová slova: Žloutkové protilátky, peptidové antigeny, ELISA, Western blot
|
|
|
Studium indukce intestinálních konjugačních enzymů doplňky stravy
Hrdinová, Johana ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Bárta, František (oponent)
Cytochromy P450 (CYP) jsou enzymy hrající důležitou roli při metabolismu exogenních látek (například léčiv, kancerogenů, polutantů) a účastnící se metabolismu hydrofobních endogenních substrátů (například sterolů, mastných kyselin, prostaglandinů). Cytochromy podrodiny CYP1A se účastní aktivace prekancerogenů. Jelikož konzumace potravních doplňků obsahujících chemopreventivní látky (například flavonoidy), které mohou bránit procesu kancerogeneze, v posledních letech výrazně stoupá, přestože tyto látky mohou mít na organismus také negativní účinek. Jsou totiž schopné cytochromy P450 indukovat, a tím navýšit riziko aktivace prekancerogenů. V této práci byl sledován indukční efekt některých flavonoidních látek: β-naftoflavonu, myricetinu, dihydromyricetinu a léčiva obsahujícího výtažek z červených listů vinné révy - Antistaxu®.
|
|
|
Příprava a charakterizace antipeptidových protilátek pro imunodetekci cytochromů P450
Mácová, Iva ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Koblas, Tomáš (oponent)
Cytochromy P450 jsou významné enzymy účastnící se metabolismu endogenních i exogenních látek. Jejich substrátem jsou také karcinogeny, které mohou aktivovat, čímž může docházet ke vzniku rakoviny. Pokud jsou tedy cytochromy P450, zodpovědné za aktivaci karcinogenů indukovány, riziko rakoviny se zvyšuje. Jedním z induktorů těchto enzymů jsou i chemopreventivní látky, které jsou v současnosti velmi oblíbené a doporučované. Proto by měl být sledován vliv chemopreventivních látek na cytochromy P450 a vznik rakoviny. Cytochromy P450 se nejčastěji vyskytují v játrech. Nicméně existují také formy, které nebyly dosud prokázány v žádné zdravé lidské tkáni, ale jejich zvýšená exprese byla zjištěna v nádorech. Z tohoto důvodu by mohly sloužit k diagnostice a prognóze rakoviny. Mezi tyto cytochromy patří CYP2S1 a 2W1, které mohou být prognostickými markery kolorektální rakoviny. Proto by bylo vhodné mít nástroje k detekci těchto enzymů. Jednou z možností je imunodetekce cytochromů P450 technikou "Western blot" pomocí specifických protilátek. Nyní jsou nejčastěji využívány savčí protilátky (IgG), avšak protilátky izolované z vaječného žloutku (IgY) získávají na popularitě zejména kvůli velkému množství nesporných výhod. Pro přípravu peptidických imunogenů byly nejprve z primární struktury CYP2S1 a 2W1 vybrány...
|
|
|
Vliv heterodimerizace sestřihových variant metabotropního glutamátového receptoru 1a a 1b na nitrobuněčnou distribuci receptorových komplexů
Dvořáková, Michaela ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Vaněk, Ondřej (oponent)
L-glutamát je hlavním excitačním neuropřenašečem v centrální nervové soustavě (CNS) obratlovců, který může zprostředkovat synaptický přenos skrze ionotropní receptory nebo jej ovlivňovat prostřednictvím aktivace metabotropních glutamátových receptorů (mGlu receptory). Glutamátové receptory jsou jako přenašeče signálů v mozku nepostradatelné. Hlavní úlohou metabotropních glutamátových receptorů je zprostředkování pomalých excitačních a inhibičních odpovědí prostřednictvím aktivace druhých poslů a regulace vápníkových a draslíkových kanálů. Glutamatergní nervový přenos má vliv na synaptickou plasticitu, různé typy paměti, učení, motorickou koordinaci a neuronální vývoj. Na druhou stranu je však glutamát spojen s excitotoxicitou, která je jednou z příčin patogenity některých chronických neurodegenerativních chorob jako jsou Alzheimerova, Parkinsonova či Huntingtonova nemoc. Metabotropní glutamátové receptory mohou být terapeutickými cíli pro léčbu psychiatrických a neurologických onemocnění. Cílený transport membránových receptorů do různých částí neuronů podmiňuje neuronální polaritu a má tudíž nezanedbatelný vliv na přijímání a přenos extracelulárních signálů. Tato práce se zabývá skladbou metabotropního glutamátového receptoru 1, konkrétně potvrzuje heterodimerizaci sestřihových variant mGluR1a a mGluR1b ve...
|
|
|
Protilátková odpověď specifických hostitelů vůči antigenům ptačích schistosom
Turjanicová, Libuše ; Mikeš, Libor (vedoucí práce) ; Kolářová, Libuše (oponent)
Tato práce zaměřená na humorální odpověď specifických hostitelů proti antigenům různých vývojových stadií ptačích schistosom T. regenti a T. szidati navazuje na předchozí výzkum protilátkové odpovědi u nespecifických hostitelů (myš, člověk). Pomocí metod ELISA a na western blotu byla testována séra experimentálně nakažených kachen a séra z ulovených divokých kachen. Séra byla odebírána v předem určených intervalech. Výsledky ELISA testu ukazují průběh humorální odpovědi po infekci ptačími schistosomami. Po infekci T. regenti se 20. d.p.i. (den po infekci) signifikantně zvýšila hladina specifických protilátek IgY proti homogenátu cerkárií T. regenti. U kachen nakažených druhem T. szidati nebyl podobný vývoj zaznamenán. Změny hladiny specifických IgM proti homogenátu cerkárií T. szidati byly zaznamenány pouze u kachen nakažených v době plné imunokompetence a u opakovaně infikovaných kachen. Jednalo se o mírné zvýšení hladiny IgM 10. d.p.i. U ulovených kachen nebyla při celkovém vyšetření prokázána infekce ptačími schistosomami, což potvrzují i výsledky ELISA. Protilátky IgY z sér kachen infikovaných T. regenti na imunoblotu silně rozpoznávaly 2 antigeny v oblasti 49-47 kDa a 47-45 kDa. Objevily se i další reakce, které však nebyly zaznamenány u všech jedinců. Western blot, při němž jako antigen...
|
|
|
Sérologický průkaz lymeské boreliózy
NOVÁKOVÁ, Iveta
Tématem této bakalářské práce je zpracování problematiky lymeské boreliózy. Onemocnění lymeské boreliózy je rozšířeno po celém světě. Původcem jsou různé druhy borelií dle geografického výskytu. Je to onemocnění, jehož přenašečem na našem území je hlavně klíště rodu Ixodes ricinus (v jiných oblastech světa jsou to i jiné druhy). Vyskytují se ve vlhkém prostředí, například v lese nebo ve vysoké trávě. Z toho vyplývá, že více ohroženi jsou lidé, kteří se v těchto lokalitách více vyskytují. Jako jsou příkladně lesníci, ale i děti, které v přírodě tráví více volného času. Lymeskou boreliózu můžeme rozdělit dle pozorovaných příznaků na tři stádia: časně lokalizované, diseminované a pozdní perzistentní stádium. Jako prvotním příznakem boreliózy je nejčastěji uváděna tvorba erythema migrans (EM). EM je vytvoření oválné načervenalé skvrny na kůži, v místě kde bylo přisáté klíště, která může postupem času samovolně vymizet. Jako další příznaky se dají uvést: boreliový lymfocytom, konjuktivitida, neuroborelióza, lymeská karditida a mnoho dalších. Proto pokud jdeme do oblastí, které jsou typická pro výskyt klíšťat, je dobré využít doporučovaných preventivních opatření před přisátím těchto roztočů. K léčbě lymeské boreliózy se využívají antibiotika, které jsou podány pacientovi až po zjištění onemocnění LB. K antibiotické léčbě se používají hlavně: cefalosporiny, makrolidy, tetracykliny nebo peniciliny. Vždycky záleží na tom, v jakém stádiu antibiotika podáváme i na tom, zda pacient má typické klinické příznaky LB. Pro laboratorní diagnostiku lymeské boreliózy se využívají přímé a nepřímé metody. Mezi přímé diagnostické metody se řadí kultivace borélií, hybridizace, imunoelektronová mikroskopie a metoda PCR (polymerázová řetězová reakce) na průkaz boreliové DNA. Dnes je z těchto metod převážně využívána metoda PCR. Z nepřímých diagnostických metod se využívá nepřímé imunofluorescence, Western blot (WB) a ELISA testu (Enzyme Linked Immunosorbent Assay). Pomocí těchto metod se stanovují především specifické protilátky třídy IgM a IgG. Cílem této práce bylo vyšetřit vzorky pacientů na lymeskou boreliózu pomocí metody ELISA testu a Western blotu, otestovat tyto metody a následně zhodnotit jejich výsledky. Jednotlivé vzorky sér, likvorů a punktátů ke zpracování mi byly poskytnuty ve Fakultní nemocnici v Plzni na oddělení sérologie a parazitologie. Před vyšetřením se musí vzorky zředit. K metodě ELISA jsem využila přístroj od firmy Dynex, DSX automatizovaný ELISA systém. Kterým se ve vzorcích stanovují protilátky třídy IgM a IgG. Jde o přístroj, kde během jednoho měření je možné vyšetřit od pacientů až 96 vzorků. Využila jsem i možnost, vyzkoušet si sama ruční stanovení ELISA testu, který se dnes moc nevyužívám, především při větším objemu přijatých vzorků. Pro další vyšetření protilátek IgM a IgG, jsem využila Western blotu a to pomocí komerční sady na ruční stanovení. Celkem jsem vyšetřila v testu ELISA 90 vzorků v třídě IgM, kde vyšly 4 hraniční a 4 pozitivní vzorky od pacientů. Stejných 90 vzorků jsem vyšetřila stejnou metodou i ve třídě IgG, kde vyšly 4 pozitivní vzorky. Dále pak metodou Western blot bylo vyšetřeno 98 vzorků. V třídě IgM vyšlo 5 hraničních a 18 pozitivních vzorků, v třídě IgG oproti tomu vyšlo 5 hraničních a 30 pozitivních vzorků. Poté musí odborný lékař zhodnotit výsledky sérologických testů a klinických příznaků a postupovat tak, aby potvrdil lymeskou boreliózu a vyloučil jiná možná onemocnění.
|
|
|
Analýza rekombinantních klonů apoptotické nukleázy v systému "leaf factory" při koinfiltraci modifikujícími geny
LOMNICKÁ, Anna
TBN1 je nukleáza s protinádorovou aktivitou. Hlavní cíl této práce bylo zjistit, jak je TBN1 a její modifikované formy stabilní v systému ?leaf factory", který je používaný k její produkci, a zda může být tato produkce zvýšena nebo ovlivněna vybranými ?modifikátory", například supresory silencingu, transkripčními faktory, glykosyltransferázami a kinázami. Rostliny Nicotiana benthamiana byly infiltrovány směsí kmenů Agrobacterium tumefaciens, které nesly rostlinný expresní vektor nukleázy a které byly koinfiltrovány s ?modifikujícími" vektory. Nukleázové a proteinové analýzy odhalily, že nukleáza TBN1 wt a její modifikované varianty jsou v použitém systému ?leaf factory" stabilní. Pokud jde o jejich molekulovou hmotnost, byly zaznamenány jen kvatitativní změny. Experimenty ukázaly, že se aktivita a produkce nukleáz zvýšila při koinfitraci se supresorem silencingu a klesla při koexpresi s vybraným transkripčním faktorem. Glykosyltransferázy a kinázy ovlivnily aktivitu a produkci jen zanedbatelně. Experimenty také odhalily, že modifikované varianty TBN1 mají rozdílnou molekulovou hmotnost, což naznačuje, že jednotlivé N-glykosylační domény mají různou délku cukerného řetězce a vliv na nukleázovou aktivitu. Naše data ukazují, že exprese in planta se zdá být vhodná pro produkci pro studium protinádorové aktivity těchto nukleáz.
|
host ::
RSS.