|
|
Targeting of viral nanoparticles to cancer specific receptors
Žáčková Suchanová, Jiřina ; Španielová, Hana (vedoucí práce) ; Němečková, Šárka (oponent) ; Ulbrich, Pavel (oponent)
Úkolem této práce bylo prozkoumat potenciál umělých virových částic (virus-like particles, VLPs) odvozených od myšího polyomaviru (MPyV) jako možných nanonosičů pro řízenou dopravu terapeutických a diagnostických látek do specifických buněk či tkání. Vybrali jsme VLPs myšího polyomaviru, protože neobsahují virovou DNA a jsou považovány za bezpečné pro využití v bioaplikacích. Při našem výzkumu jsme použili přístup chemické modifikace pro přesměrování VLPs z jejich přirozeného receptoru na nádorové buňky. Lysinové zbytky exponované na povrchu částice byly modifikovány aldehydickým činidlem pro následnou konjugaci vybraných molekul, transferinu a inhibitoru glutamát karboxypeptidázy II (GCPII), na povrch částice. Transferin, transportér iontů železa do metabolicky aktivních buněk, pomohl k přesměrování VLPs do různých druhů nádorových buněk nadměrně produkujících transferinový receptor. Na druhou stranu, GCPII slouží jako transmembránový antigen specificky se vyskytující na buňkách nádoru prostaty a připojení malé molekuly inhibitoru k VLPs vedlo k úspěšnému rozpoznání těchto buněk. Použili jsme metodu elektronové mikroskopie k vizualizaci obou typů modifikovaných VLPs a metody průtokové cytometrie a konfokální mikroskopie pro studium specifických buněčných interakcí a internalizace nanočástic. Dále...
|
|
|
Zinc-Dependent Hydrolases: Structure-Function Study of Glutamate Carboxypeptidase II and Histone Deacetylase 6
Škultétyová, Ľubica ; Bařinka, Cyril (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent) ; Novák, Petr (oponent)
Proteiny vázající zinek představují přibližně desetinu proteomu a významnou část z nich tvoří hydrolasy závislé na zinku. Tato disertační práce se zaměřuje na biochemickou a strukturní charakterizaci glutamátkarboxypeptidasy II (GCPII) a histondeacetylasy 6 (HDAC6), které jsou členy rodiny metalohydrolas závislých na zinku, a popisuje interakce s jejich přirozenými substráty a inhibitory. GCPII je homodimerní membránová proteasa, která v centrální a periferní nervové soustavě katalyzuje odštěpení glutamátu z neuropřenašeče N-acetyl-aspartyl glutamátu (NAAG) a v tenkém střevě z folátů přijatých v potravě. Tento enzym je spojován s několika neurologickými poruchami a představuje také ideální cíl pro diagnostiku a léčbu rakoviny prostaty. Inhibitory GCPII obvykle nesou skupinu vázající zinek a dále obsahují funkční skupinu specificky rozpoznávanou v S1' místě enzymu (tvořenou glutamátovým zbytkem nebo jeho isosterem). Tyto sloučeniny jsou přirozeně hydrofilní molekuly, což brání jejich průniku přes hematoencefalickou bariéru a znemožňuje inhibici GCPII v centrální nervové soustavě. V této disertační práci představujeme různé strategie zaměřené na záměnu tradičního P1' glutamátového zbytku nevětvenými neproteinogenními aminokyselinami a bioisostery glutamátu. Dále pak sledujeme vliv zavedení...
|
|
|
Human glutamate carboxypeptidases II and III
Navrátil, Michal ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Zde presentovaná doktorská disertační práce popisuje kinetickou a strukturní characterisaci lidských glutamátkarboxypeptidas II a III (GCPII a GCPIII) za použití jejich přirozených substrátů. Tyto enzymy odštěpují C-koncový glutamát z jejich substrátů. Proteiny sdílejí 67 % sekvenční identitu a také podobné enzymové aktivity. Tato disertační práce kvantitativně porovnává lidskou GCPII a GCPIII co se týče jejich schopnosti hydrolysovat endogenní substráty N-acetyl-L-aspartyl-L-glutamát (NAAG), folyl-poly-γ-L- glutamové kyseliny (FolGlun) a β-citryl-L-glutamát (BCG). Prokázali jsme, že hydrolysa těchto substrátů pomocí GCPIII je závislá na přítomnosti kationtů kovů, že BCG je specifický substrát GCPIII, a že NAAG a FolGlun jsou specifické substráty GCPII. Rovněž přinášíme nepřímé biochemické důkazy o tom, že GCPIII by mohla mít v aktivním místě heterometalický klastr. Také jsme charakterisovali relevanci povrchového vazebného místa v GCPII, takzvaného aromatické skupiny vázajícího místa (ASVM), pro hydrolysu FolGlun substrátů za použití metody cílené mutagenese basí DNA a enzymové kinetiky a ukázali jsme, že polymorfní varianta GCPII His475Tyr hydrolysuje substráty FolGlun se stejnými kinetickými parametry jako divoký typ. Dále se tato disertační práce se zaměřuje na strukturní aspekty substrátových...
|
|
|
Chemically modified Murine Polyomavirus-like particles and their interaction with Prostate-Specific Membrane Antigen (PSMA)
Blažková, Kristýna ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Horníková, Lenka (oponent)
Rakovina prostaty patří mezi nejčastější nádorová onemocnění u mužů a je tedy velká poptávka po cílené léčbě. V této diplomové práci popisuji využití Glutamát karboxypeptidázy II (GCPII) jako vhodného cíle pro možné cílení. GCPII je transmembránový protein, který internalizuje po navázání ligandu, a jeho exprese v nádorech prostaty je významně zvýšená. Virům-podobné částice z myšího polyomaviru (VLPs) jsou vhodným nosičem pro vizual- izaci a léčbu. Zde popisuji modifikace VLPs inhibitory GCPII a charakterizaci jejich vazby na GCPII pomocí povrchové plasmonové rezonance a vazby na buňky exprimující GCPII pomocí konfokální mikroskopie. VLPs s inhibitory GCPII vykazují specifickou vazbu GCPII na povrchové plasmonové re- zonanci, bohužel se tato specificita ztrácí při vazbě na buňky. Jedním přístupem, jak tuto ne- specifitu odstranit, byla substituce v BC smyčce kapsidového proteinu VP1 na vnějším povrchu VLPs, která by měla být spoluodpovědná za vazbu kyseliny sialové. Tato substituce však neomezila nespecifitu částic. Dalším testovaným přístupem bylo obalení VLPs velkými poly- mery nesoucími fluorescenční značku i inhibitor GCPII. Po obalení VLPs vykazovaly tyto čás- tice v předběžných experimentech specifickou vazbu a internalizaci v buňkách exprimujících GCPII. Tyto výsledky...
|
|
| |
|
|
Mass Spectrometry-Based Identification of a Potential Binding Partner of Glutamate Carboxypetidase II
Tužil, Jan ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Novák, Petr (oponent)
Český abstrakt Systémová biologie bude vyžadovat použití nových metod s vysokou propustností dat pro studium protein-proteinových interakcí. Proteomika založená na hmotnostní spektrometrii prošla v posledních letech rychlým vývojem a stala se nepostradatelným nástrojem studia makromolekul v základním i klinickém výzkumu. Glutamátkarboxypeptidasa II (GCPII; EC 3.5.17.21) je transmembránový protein se dvěma známými enzymovými aktivitami. Tento enzym je exprimován ve větším množství v buňkách některých pevných nádorů a také obecně v neovaskulatuře pevných nádorů, nehraje zde však fyziologickou roli. Některé skutečnosti mohou poukazovat na potenciální receptorovou funkci GCPII, přirozený ligand tohoto proteinu však nebyl doposud identifikován. Pro hledání možných vazebných partnerů a/nebo ligandů GCPII byly použity metody afinitní chromatografie, imunoprecipitace a hmotnostní spektrometrie. Byla optimalizována metodika přípravy vzorků pro hmotnostní spektrometrii a analýza získaných dat s cílem nalézt možné vazebné partnery. Jeden z identifikovaných proteinů- β-podjednotka F1 ATP-syntasy, byl vybrán pro důkladnější analýzu možné interakce s GCPII.
|
|
|
Purifikace monoklonálních protilátek a příprava nosiče pro izolaci glutamátkarboxypeptidasy II z biologického materiálu
Parolek, Jan ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Bořek Dohalská, Lucie (oponent)
K léčbě benigních i maligních nádorových onemocnění je žádoucí hledat specifičtější, méně zatěžující druhy léčby. Jedním z cílů vylepšení metod léčby neoperovatelných nádorů je co nejmenší poškození okolních zdravých tkání při likvidaci nádoru. Značný pokrok nastal při výzkumu a aplikaci protilátek, jež mohou buňky exprimující určité struktury nejen označit, ale i přímo likvidovat. Nádorové buňky se však od těch zdravých liší jen velmi málo. Tento fakt představuje hlavní problém při léčbě, protože většina látek toxických pro nádor v různé míře negativně ovlivňuje celý organismus. Z tohoto důvodu je nutné hledat nové markery pro léčbu rakovinných onemocnění. Monoklonální protilátky je možné spojit s molekulou léčiva (cytotoxická substance, radionuklid aj.). Vzniklé konjugáty jsou z hlediska léčby nádorů velmi perspektivní, protože protilátka vyhledá cílovou strukturu s velkou specifitou a léčivo může být dodáno lokálně, s minimální zátěží pro organismus pacienta. Jedním ze specifických markerů nádorových onemocnění prostaty se stala glutamátkarboxypeptidasa II (GCPII), integrální membránový protein vysoce exprimovaný epiteliálními buňkami karcinomu prostaty. K dalšímu zkoumání GCPII je nutné mít k dispozici dostatečně čisté protilátky. Monoklonální protilátky proti GCPII s označením GCPII-05,...
|
|
|
Příprava a charakterisace rekombinantního dermcidinu jako potenciálního proteinového partnera glutamátkarboxypeptidasy II
Tužil, Jan ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Proces novotvorby cévního zásobení je klíčový pro růst a přežití jakéhokoliv pevného nádoru. Zatímco většina nádorů zůstává nevaskularizována a zpravidla nepřesáhne svou velikostí několik milimetrů, některé novotvary prochází tzv. angiogenním přechodem, v důsledku čehož začne docházet tvorbě krevních tělísek. Počet buněk podstupujících apoptosu se snižuje a nádor se začíná rozrůstat. Je známo několik dobře prostudovaných faktorů, jež ovlivňují fyziologické děje spojené s novotvorbou cév. Tyto látky se mohou, ale nemusí vyskytovat i v tkáních nádoru. Glutamátkarboxypeptidáza II (GCPII; EC 3.4.17.21) je transmembránový glykoprotein II. typu, u něhož byly objeveny dvě fyziologicky významné enzymatické aktivity. GCPII je exprimována ve vaskulatuře pevných nádorů, přičemž zde však nebyla pozorována žádná funkce spojená s těmito aktivitami. Přestože se spekuluje o možné receptorové funkci GCPII, přirozený ligand dosud nebyl identifikován. Předcházející experimenty v naší laboratoři naznačily možnost interakce některých proteinů s GCPII. Jeden z nich- dermcidin byl vybrán jako možný vazebný partner, byl naklonován, exprimován v savčích buňkách a poté byla prověřena jeho možná interakce s GCPII pomocí nového detekčního systému využívajícího kotvu FLAG. Interakci in vitro se však nepodařilo potvrdit ani vyvrátit.
|
|
|
Syntéza 5'-UTR varianty Var14 genu GCPII jako standardu pro RT-PCR
Petrovová, Gabriela ; Ingr, Marek (vedoucí práce) ; Černá, Věra (oponent)
Cílem této práce bylo připravit syntetickou sekvenci 5'UTR sestřihové varianty Var 14 glutamátkarboxypeptidasy II (GCPII). K tomu byla použita metoda dvoukrokové PCA. Sekvence byla rozdělena do 8 překrývajících se oligonukleotidů a spojena do jedné dsDNA pomocí dvou po sobě jdoucích PCR. Produkt syntézy byl zaklonován do pomocného vektoru pUC19. Po jeho osekvenování byly opraveny nalezené mutace. Produkt byl subklonován do cílového vektoru pcDNA4 His Var 14 již obsahujícího sekvenci vlastního genu GCPII. Tento konstrukt byl následně použit k sestrojení kalibrační křivky, která bude i nadále sloužit jako standard pro RT-PCR pro zjištění kvantity této varianty GCP II u pacientů s rakovinou prostaty. Konstrukt bude také používán jako expresní vektor pro produkci Var 14 varianty GCPII v eukaryontním baculovirovém expresním systému. Klíčová slova: 5'UTR, dvoukroková PCA, pUC19, RT-PCR, GCPII
|
|
|
Preparation, expression and characterization of mouse GCPIII
Bäumlová, Adriana ; Šebo, Peter (oponent) ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce)
Slovenský abstrakt Glutamátkarboxypeptidáza II (GCPII, EC 3.4.17.21) je transmembránovým glykoproteínom II typu, ktorý bol objavený v nervovom systéme na základe degradácie N-acetyl-L-aspartyl-L-glutamatu na N-acetyl-L-aspartát a L-glutamát, a preto sa predpokladá jeho účasť na nervovej signalizácií. Okrem mozgu, GCPII bola objavená vo väčšej miere taktiež v prostate, obličkách a tenkom čreve. V tenkom čreve GCPII napomáha vstrebávaniu folátov z potravy tým, že odštepuje koncové glutamáty z polyglutamylovaných folátov. V prostate nie je funkcia tohto proteínu doposiaľ známa, avšak využíva sa ako márker rakoviny. Mus musculus je dôležitým modelom pre štúdium GCPII a jej homológov ako terapeutického ciela. Ľudská GCPII a jej paralóg GCPIII sú pomerne dobre charakterizované, zatiaľ čo žiadna biochemická štúdia o ich myších ortológoch nie je dostupná. Preto sme myšaciu glutamátkarboxypeptidázu III (mGCPIII) naklonovali, pripravili rekombinantnou expresiou v hmyzích bunkách a chrakterizovali. Ukázali sme, že mGCPIII vykazujeα-glutamátkarboxypeptidázovú aktivitu, ktorá je inhibovatelná špecifickým inhibítorom GCPII, 2-PMPA. Taktiež sme testovali citlivosť a špecifitu monoklonálnych protilátok voči myšacej GCPIII. Imunochemická detekcia odhalila, že protilátka GCP-04 rozpoznáva ľudskú GCPII rovnako dobre ako...
|
host ::
RSS.