|
Role reaktivních forem kyslíku a proteinové fosforylace na funkci spermií ryb
GAZO, Ievgeniia
Spermie druhů ryb s vnějším oplozením jsou po uvolnění do vodního prostředí zvláště citlivé na poškození hlavně kvůli změnám ve složení média v okolní spermatu. Mezi faktory ovlivňující pohyb spermií v externím médiu jsou: znečištěná voda, teplota, pH a osmotické podmínky. Cílem této studie bylo zjistit, účinky oxidačního stresu a možné následky související s výkonností spermií a intracelulární signalizací, zejména díky vlivu znečišťujících látek, vyskytujících se ve vodním prostředí. Navíc molekulární mechanismy stresových reakcí a aktivační proces pohyblivosti spermií byly analyzovány u více druhů sladkovodních ryb. Naše výsledky prokázaly, že xenobiotika, jako je Vinclozolin, mohou vyvolat snížení pohyblivosti a rychlosti spermií u jesetera malého (Acipenser ruthenus) již při koncentracích vyskytující se přirozeně ve vodním prostředí. Zvýšené hladiny lipidové oxidace (LO) a proteinové karbonylace (CP), stejně jako změny v antioxidačním účinku superoxid-dismutázy (SOD) poukazují na vývoj oxidačního stresu u spermií, které byly předem vystaveny xenobiotikům. Dále byla pozorována zvýšená fragmentace DNA a snížená úroveň ATP u spermií, které byly ovlivněny cizorodými látkami in vitro. Tyto výsledky naznačují, že spermie jesetera malého jsou velmi citlivé na přítomnost škodlivých látek a nadměrnou produkci ROS, které jsou vyvolány již při nízkých koncentracích. Další studie byly provedeny za účelem vyhodnotit úlohy produkce ROS u rybích spermií a potvrdit ochranné vlastnosti semenné tekutiny. ROS byl vygenerován inkubací kapřích (Cyprinus carpio L.) spermií in vitro s xanthin - xanthinoxidázou systémem (X-XO). Dávka škodlivé látky a doba působení měly vliv na snížení pohyblivosti a rychlosti spermií, stejně tak byla pozorována zvýšená hladina LO, CP a DNA fragmentace. Navíc bylo prokázáno, že O-spojeno s N-acetylglukosamin transferázou a septin-8-A změnil jejich stav fosforylace a kyselá fosfatáza v reakci na oxidační stres byla snížena. Na druhé straně, kataláza (CAT), superoxiddismutáza (SOD), glutathion a (GTH) v kombinaci se semennou plazmou má vliv na snížení oxidačního stresu u spermií kapra a zvýšení jejich kvality. Naše další studie byla použita ke stanovení, jak byly fosforylací proteiny pozměny po aktivaci pohyblivosti spermatu u kapra a jesetera, kde se fosforylované proteiny nacházejí ve spermatu a identifikované proteiny jsou zapojeny do procesu pohyblivost spermií. Ukázalo se, že typ proteinové fosforylace a její lokalizace se značně liší u obou druhů ryb. Fosforylace na serinovém a tyrosinovém zbytku, stejně jako protein-kináza A (PKA) a protein-kináza C (PKC) hrají důležitou roli u pohyblivosti, aktivace a regulaci spermií u obou druhů. Nespočet signalizačních proteinů podílejících se na pohybu spermií kapra a jesetera, byly identifikovány v této studii, a tudíž máme o krůček lepší pochopení molekulárních mechanismů u parametru pohyblivost spermií. Na závěr, výsledky této studie poskytují nové údaje o vlivu xenobiotik a oxidačního stresu na pohyblivosti rybích spermií, integritu DNA, lipidové a proteinové oxidaci, antioxidační obranný systém a intracelulární signalizaci. Naše údaje prokázaly toxicitu znečišťujících látek ve vodě a ROS u rybích spermií a navrhované využití CAT, SOD, nebo GTH v kombinaci se semennou plazmou pro snížení oxidačního stresu ve spermatu. Navíc bylo identifikováno mnoho proteinů ve spermiích, podílejících se na stresové reakci a pohyblivosti. Pro praxi, údaje uvedené v této práci, by mohly být užitečné pro zpracování médií vhodné pro kryoprezervaci a umělé rozmnožování různých druhů sladkovodních ryb.
|
|
Plasma-membrane alkali-metal-cation transporters involved in salt tolerance of pathogenic Candida species
Krauke, Yannick ; Sychrová, Hana (vedoucí práce) ; Malcová, Ivana (oponent) ; Heidingsfeld, Olga (oponent)
of Ph.D. Thesis Conclusions All the aims of the thesis were achieved. The tolerance to alkali metal cations of four pathogenic Candida species was studied in detail and revealed differences among the yeasts. These differences in sall tolerance remained the same under various growth conditions. For the first time, the internal sodium and potassium concentrations of several Candida species were estimated under high salt-stress grolvth. The internal K./Na* ratio was not in relation with the salt tolerance revealing different adaptation mechanisms to salt stress in Candida species. A first study on combinatory use of fluconazole and NaCl revealed severe synergistic effects of both compounds, leading to grovvth inhibition and increased internal Na* concentrationsi n C. albicans.T he molecularb asis of this synergismr emains to be established. Ihe C. dubliniensis, C. glabrata and C. parapsilosis Cnhl NalH- antiporters were cloned and functionally characterized upon heterologous expression in S. cerevlslae to understand the mechanisms involved in the different salttolerances of Candida species. The three antiporters differed in their activity for alkali metal cations, which roughly correlated with the observed differences in salt tolerance among the species. Additionally, during the characterization of...
|
|
Subcelulární lokalizace a úloha komplexu exocyst v savčích buňkách během cytokineze
Ulrychová, Lenka ; Hudeček, Jiří (vedoucí práce) ; Entlicher, Gustav (oponent)
Posledním krokem buněčného cyklu je cytokineze. Během ní dojde k oddělení dvou dceřiných buněk. Tohoto procesu se účastní množství membránových struktur jako jsou endoplazmatické retikulum a trans-Golgi komplex. Kromě toho je v posledních letech stále více zdůrazňována úloha recyklačních endozomů. Všechny tyto organely spolu vzájemně komunikují pomocí vnitrobuněčného transportu, který je velice důležitý pro úspěšný průběh cytokineze zejména z pohledu nově vznikající plazmatické membrány oddělujících se dceřinných buněk. Nedávné studie odhalily, že tato membránová dynamika je regulována tzv. malými GTPázami z proteinové nadrodiny Ras. Další proteiny s významnou úlohou během membránového transportu jsou takzvané poutací komplexy, které směrují příslušné vnitrobuněčné komponenty k cílové plazmatické membráně, kde usnadňují vzájemnou fúzi. Nejlépe prozkoumaným poutacím komplexem je exocyst komplex. Jeho přítomnost byla prokázána ve všech typech eukaryotních buněk. Tento proteinový komplex je složený z osmi podjednotek Sec3, Sec5, Sec6, Sec8, Sec10, Sec15, Exo70 a Exo84. Ačkoliv přesný mechanizmus zůstává neznámý, zdá se, že dochází k interakcím mezi podjednotkami exocyst komplexu a zástupci Ras rodiny proteinů. Je proto možné, že se tyto proteiny podílejí na regulaci transportu vnitrobuněčných váčků...
|
|
Vliv dostupnosti sloučenin železa na expresi molekul zúčastněných v transportu netransferinových iontů železa: In vitro studie na lidských buněčných liniích K562 and Caco-2
Balušíková, Kamila
Vzhledem k absenci regulačních mechanismů zajišťujících vylučování iontů železa z organismu je velmi přísně kontrolována jejich absorpce. Předmětem našeho zájmu je tedy transportní mechanizmus nehemových iontů železa zprostředkovaný molekulami DMT1 (divalent metal transporter 1, membránový importér železa), Dcytb (duodenal cytochrom b, membránová ferrireduktáza), ferroportinem 1(membránový exportér železa), hefestinem (membránová ferroxidáza) a ceruloplasminem (cytoplazmatická ferroxidáza), který umožňuje příjem iontů železa z potravy až po jeho navázání na cytoplazmatický transferin. Projekt je zaměřen na sledování vlivu dostupnosti železa na expresi zmíněných molekul zúčastněných v transportu netransferinových iontů železa s cílem zjistit, jak při deprivaci, respektive nadbytku železa, dochází k regulaci příjmu železa danými proteiny u buněčných linií reprezentujících různé typy tkání. Buněčné linie jsme kultivovali v mediu RPMI-1640 doplněném o další složky. Expresi jednotlivých molekul jsme sledovali na úrovni mRNA pomocí metody "Real-Time" PCR s reverzní transkripcí v in vitro studii na lidských buněčných liniích K562 a Caco-2. Buňky K562 (lidská erytroleukemie) jsou modelem neenterocytárních buněk představující významné utilizátory iontů železa. Model enterocytárních buněk s odlišnou apikální...
|
|
Studium membránových receptorů pomocí vazby radioligandů
Rejhová, Alexandra ; Hudeček, Jiří (vedoucí práce) ; Hejnová, Lucie (oponent)
Závislost na drogách, resp. opioidech, je celospolečenským problémem, jehož závažnost je v současné době na vzestupu. Se zneužíváním návykových látek je spojen také fenomén tolerance ke zvyšující se dávce a abstinenční syndrom způsobený vysazením drogy a bažení po droze (tzv. craving). Receptory pro opioidy patří do velké skupiny receptorů spřažených s G-proteiny (GPCR), jejichž vlastnosti lze zkoumat metodou agonistou-stimulovanou vazbou [35 S]GTPγS. Mnoho extracelulárních signálů je zprostředkováno do buňky prostřednictvím GPCR. Agonisté opioidních receptorů inhibují aktivitu adenylylcyklasy a jsou spřaženy s G-proteiny skupiny Gi/Go. Tato práce je věnována studiu změn izolovaných plasmatických membrán obsahujících opioidní receptory z předního mozku potkanů zdravých jedinců s plasmatickými membránami získanými z jedinců, kterým bylo dlouhodobě podáváno morfium ve zvyšujících se dávkách tak, aby vznikla závislost. Srovnávání je prováděno jednak pomocí vazby [3 H]ouabainu na Na,K-ATPasu, která se projeví jako negativní standard změn, jednak pomocí vazby [35 S]GTPγS na G-protein, čímž je stanovena funkční aktivita G-proteinu při stimulaci vazby agonistou δ-opioidních receptorů DADLE nebo agonistou µ-opioidních receptorů DAMGO. Dále byl zkoumán vliv prostaglandinu E1 na vazbu [35 S]GTPγS po...
|
|
Vliv n-3 polynenasycených mastných kyselin v dietě na regulaci sekrece inzulínu a glukózové homeostázy u myší
Doleželová, Šárka ; Rossmeisl, Martin (vedoucí práce) ; Neckář, Jan (oponent)
Příjem polynenasycených mastných kyselin s dlouhým řetězcem řady n-3 (n-3 LC-PUFA), konkrétně kyseliny eikosapentaenové (EPA) a dokosahexaenové (DHA) má hypolipidemický účinek a působí preventivně proti rozvoji kardiovaskulárních onemocnění. Jedním z hlavních cílů n-3 LC-PUFA je tuková tkáň, kde aktivují tzv. "metabolické přeprogramování" vedoucí ke zlepšení lipidového a glukózového metabolismu. V této práci nahrazení části tuků n-3 LC-PUFA snižuje hladiny volných mastných kyselin, akumulaci triacylglycerolů v játrech a zlepšuje systémovou citlivost k inzulínu u myší krmených vysokotukovou dietou. Také bylo pozorováno mírné snížení objemu -buněk a méně nefunkčních -buněk při příjmu n-3 LC-PUFA. Inkretinové hormony jsou sekretovány ze střevních buněk v odpověď na příjem potravy a zesilují glukózou stimulovanou sekreci inzulínu. Tato práce také vyhodnocovala vliv n-3 LC-PUFA v dietě na sekreci inzulínu indukovanou po intraperitoneálním nebo orálním podání glukózy. Výsledky ukázaly, že n-3 LC-PUFA usnadňují vstřebávání glukózy do tkání v odpověď na její orální podání, a že tento efekt lze přičíst vyšší sekreci inzulínu v porovnání s intraperitoneálním podáním glukózy. Tyto výsledky naznačují, že zvýšení sekrece inkretinů při chronickém podávání n-3 LC-PUFA může být odpovědné za zlepšení glukózového metabolismu...
|
|
Bordetella Adenylate Cyclase: Molecular Mechanism of Action and Its Use for Antigen Delivery
Kamanová, Jana
Název disertační práce: Adenylátcyklázový toxin bakterie Bordetella pertussis: molekulární mechanismus působení a jeho využití jako nosiče antigenů Autor: Jana Kamanová Souhrn První část této dizertační práce se věnuje molekulárnímu mechanismu působení adenylát-cyklázového toxinu (CyaA). Tento protein z rodiny RTX toxinů je sekretovaný gramnegativní bakterií Bordetella pertussis, která způsobuje infekční onemocnění nazývané černý kašel. CyaA hraje klíčovou roli ve schopnosti tohoto patogena kolonizovat sliznice horních cest dýchacích a to díky schopnosti potlačovat baktericidní funkce myeloidních fagocytujících buněk imunitního systému hostitele. CyaA se váže na integrin CD11b/CD18 (označovaný také jako CR3 nebo αMβ2) těchto buněk, vytváří v jejich buněčných membránách malé kation-selektivní kanály, a dopravuje do jejich cytozolu N-koncovou adenylát- cyklázovou (AC) doménu. Ta je po svém průniku do buněčného cytozolu aktivována navázáním eukaryotického kalmodulinu a katalyzuje velmi efektivní přeměnu ATP na cAMP, jednu z klíčových molekul buněčné signalizace. Tím dochází v napadených buňkách k nárůstu hladiny cAMP, což vyvolá rychlou ztrátu schopností fagocytózy pomocí Fc-receptorů a oxidativního vzplanutí těchto buněk. CyaA má unikátní schopnost přenášet svou AC doménu do cytozolu buněk přímo z...
|
|
Formation of RONS in cold air plasma activazed water and their effects on cell membranes of Escherichia coli
Tarabová, B. ; Machala, Z. ; Doležalová, Eva ; Lukeš, Petr
In this work, we focused on the detection of secondary reactive oxygen and nitrogen species (RONS) formed by cold plasma induced gas-liquid chemistry in air discharge activated water and liquids. Plasma induced chemical changes in plasma activated water (PAW) were correlated with the antibacterial effect, sublethal injury of bacterial cells and peroxidation of membrane lipids. The contribution of the electric field induced by the plasma treatment was evaluated by the detection of membrane permeabilization. The bactericidal effects of direct (plasma and PAW) and indirect (only PAW) treatments were compared with long-term preservation of the PAW with its antibacterial properties
|
|
Význam necholesterolových sterolů a profilu mastných kyselin za různých patofyziologických stavů
Vecka, Marek ; Tvrzická, Eva (vedoucí práce) ; Zadák, Zdeněk (oponent) ; Kazdová, Ludmila (oponent)
Disertační práce se zabývala významem stanovení necholesterolových sterolů a mastných kyselin za různých patofysiologických stavů. Metodická část disertační práce se zabývala některými aspekty analysy mastných kyselin a necholesterolových sterolů pomocí plynové chromatografie. Pro analysu minoritních mastných kyselin je důležitý jak druh použité kapilární kolony, tak i možnosti integračního software. Plynová chromatografie přispívá k celkové chybě analysy mastných kyselin nejmenší měrou. Vliv extrakce, tenkovrstevné chromatografie a methylačního procesu je podobný. Porovnání zastoupení mastných kyselin v lipidových třídách lipoproteinů s velmi nízkou a nízkou hustotou odhalilo rozdíly, které ale byly vysoce individuální. Vyšetření profilu mastných kyselin ve fosfatidylcholinech krevního sera ukázalo, že je možno nahradit fosfatidylcholiny sumou všech fosfolipidů. U analys sterolů byla dána přednost acetylaci pro lepší analytické podmínky za podmínek nástřiku typu split. Současné stanovení necholesterolových sterolů vedle cholesterolu v jediné chromatografické analyse nebylo možné, pro kvantitativní stanovení bylo nutné použít metodu dvou vnitřních standardů a různého ředění vzorku, tj. dvou analys. Porovnáním příspěvků jednotlivých kroků analysy necholesterolových sterolů jsme ukázali, že kvantitativní...
|
|
Epididymal maturation – a crucial step in the post-testicular sperm development
Postlerová, Pavla ; Pohlová, Alžběta ; Zigo, Michal ; Jonáková, Věra
Mammalian spermatozoa after their development in testis undergo the post-testicular maturation in epididymis where acquire their fertilization ability and competence of movement. The epididymis is tissue with very active fluid-absorbing and fluid-secreting activity. Epididymal fluid contains ions and small molecules, proteins, glycoproteins and enzymes. The surface of spermatozoa is exposed directly to the epididymal fluid, and the sperm plasma membrane is significantly changed. Some testicular proteins are altered, masked, or replaced by new proteins/glycoproteins of epididymal origin. Several proteins produced by epididymis have been described in various mammalian species and shown to be associated with spermatozoa suggesting a role in the sperm maturation and/or sperm-egg binding and fusion. We isolated proteins from fluid, tissue and sperm of boar epididymis, and separated them by chromatographic and electrophoretic methods. We searched for known proteins using panel of antibodies and tested proteins of epididymal fluid for binding abilities. In the epididymis, we found proteins described as proteins of seminal plasma and associated with the sperm surface, such as spermadhesins, beta-microseminoprotein and acrosin inhibitor. These proteins were detected in epididymal sperm, fluid and tissue. We showed that some epididymal proteins may bind the spermatozoa and change the binding sites on the sperm surface. We determined and identified some proteins from boar epididymal fluid with affinity to heparin, hyaluronan and zona pellucida glycoproteins. These phenomena indicate that epididymal fluid proteins bind to the sperm surface during epididymal maturation and might subsequently play role in the sperm capacitation or sperm-zona pellucida binding.
|
host ::
