|
Oprava oxidačního poškození DNA a její vztah k cytotoxickému účinku oxidantů
Havlínová, Alena ; Herink, Josef (vedoucí práce) ; Hochmann, Jiří (oponent)
H2O2 je silný oxidant a intenzivně tak ovlivňuje všechny struktury buňky. Obzvláště nebezpečné je pak oxidativní poškození DNA, které je považováno za jednu z příčin kancerogeneze, mutageneze a stárnutí. My jsme se v naší práci zaměřili na vztah mezi cytotoxickým efektem H2O2 a opravou oxidativního poškození DNA způsobeného H2O2. Zároveň jsme zkoumali účinek epigallokatechin gallátu (EGCG), u kterého již řada studií potvrdila v určitých koncentracích ochranný vliv na DNA. V experimentech jsme používali test cytotoxicity, jímž jsme zjišťovali míru inhibice tvorby kolonií a dále kometový test (comet assay), pomocí kterého jsme měřili množství jednořetězcových zlomů (SSB) v DNA vztažených na 109 daltonů. Pracovali jsme převážně s buňkami AA8, v rámci jednoho pokusu také s NER deficientní buněčnou linií UV-20. Došli jsme k závěru, že EGCG v koncentracích 12,5 a 25 g/ml významným způsobem ochraňoval buňky před cytotoxickým účinkem H2O2. Sledováním reparace indukovaného oxidativního poškození DNA jsme zjistili, že EGCG neovlivňuje opravu přímých zlomů DNA, ale že významně urychluje opravu oxidovaných purinů a pyrimidinů. Na jeho ochraně před cytotoxickým působením H2O2 se tedy pravděpodobně z velké části podílí právě toto zrychlení opravy oxidovaných bazí a dále pak patrně jeho schopnost "vychytávat"...
|
|
Oxidativní poškození DNA a jeho vztah k cytotoxickému účinku
Blahová, Hana ; Hochmann, Jiří (vedoucí práce) ; Polívková, Zdeňka (oponent)
Tato práce je zaměřena na studium oxidačního poškození DNA vyvolaného účinkem hydrogenperoxidu a na vztah tohoto poškození k cytotoxickému účinku. Opravu oxidačního poškození DNA a schopnosti přežití buněk jsme sledovali jednak u linie normálních ovariálních buněk křečíka čínského AA8, a jednak u mutantní linie těchto UV-20. Pro stanovení poškození DNA jsme použili metodu modifikované jednobuněčné gelové elektroforézy - kometový test. Cytotoxický účinek jsme hodnotili pomocí testu inhibice tvorby kolonií. Normální buňky AA8 i mutantní buňky UV-20 opravují oxidační poškození DNA přibližně stejně rychle a také jsou stejně vnímavé k cytotoxickému účinku peroxidu vodíku. Tyto výsledky naznačují, že defekt v mechanizmu nukleotidové excizní reparace u buněk UV- 20 nehraje v odezvě těchto buněk na oxidativní poškození DNA žádnou podstatnou roli, a že se tedy tento mechanizmus na odstranění oxidačního poškození DNA nepodílí. To svědčí pro to, že hlavním mechanizmem opravy oxidačního poškození DNA je mechanizmus bázové excizní opravy. Klíčová slova: Oxidativní poškození DNA, hydrogenperoxid, kometový test, excizní reparace.
|
|
Oprava oxidativního poškození DNA u vybraných buněčných linií lidského a křeččího původu
Strejčková, Lada ; Hochmann, Jiří (vedoucí práce) ; Polívková, Zdeňka (oponent)
1. SOUHRN Jedním z mechanismů oprav DNA poškozené vlivem vnějších činitelů je nukleoti- dová excizní reparace (NER). Ta hraje roli především při odstraňování následků způsobených UV zářením. Poškozené báze se ve formě pyrimidinových dimerů enzymaticky vyštěpují z DNA jako součást oligonukleotidů. Působení UV světla na DNA se však projevuje též nepřímo, a to oxidací bází. V našem experimentu jsme se snažili zjistit, zda buňky deficientní v nukleotidové excizní reparaci jsou schopny opravovat poškození indukované pouze oxidativním činitelem. Stanovovali jsme velikost poškození DNA v buňkách in vitro a schopnost jejich re- parace po ovlivnění roztokem peroxidu vodíku o různé koncentraci. K experimentům jsme použili buněčné linie křečíka čínského, a to rodičovské buňky AA8 a od nich odvozené buňky UV-20, které jsou defektní v genu ERCC1. Tento gen se podílí na tvorbě nukleáz účastnících se nukleotidové excizní reparace. Ke stanovení jsme použili metodu alkalického kometového testu, jejíž základem je alkalická gelová elektroforéza. Princip této metody spočívá v detekci zlomů, které vznikají v poškozených alkalilabilních místech. Hodnotili jsme počet jednořetězcových zlomů DNA. Detekovali jsme buď zlomy indukované samotným peroxidem vodíku (SSB), nebo zlomy vzniklé po působení enzymu, který v DNA specificky...
|
|
Inaktivace ICAM-1 genu metodou oligonukleotidů modifikovaných lysinem
Kocourková, Aneta ; Štaud, František (vedoucí práce) ; Nachtigal, Petr (oponent)
V této studii se projevuje nadějná možnost zvýšení genové exprese konjugací ligandů na antisense oligonukleotidy a siRNA. Při modifikaci se využilo 2'-O-lysylaminohexylové skupiny vázané na uridinovou bazi, která nahradila jednu, dvě až tři baze thyminové. Uvedené záměny a modifikace bazí byly testovány pro zlepšení inhibice proteinové exprese. Efektivita modifikací v inhibici proteinové exprese byla zkoušena na alicaforsenové sekvenci (DNA) a siRNA. Alicaforsen, který se nachází ve třetí fázi klinické studie, je phosphorothioát komplementární k ICAM-1, siRNA, jenž nově prokázala afinitu k ICAM-1, čehož bylo využito při porovnání účinnosti výše zmíněných modifikací a objevení následných možností uplatnění alicaforsen a siRNA v terapii. Poprvé byla pozorována a prokázána down-regulace ICAM-1 na buněčné linii ECV304, která imituje prostředí hematoencefalické bariéry. Nemodifikované/modifikované sekvence oligonukleotidů a siRNA byly transfekovány do ECV304 buněk. Po 24 hodinové transfekci byly buňky rozrušeny chemickou lýzou. Koncentrace získaných proteinů byly stanoveny Bradford analýzou a následná inhibice ICAM-1 byla vyhodnocena western blotem. Hodnoty inhibicí byly standardizovány k odpovídajícímu aktinu a kontrolním buňkám. Vyhodnocení genové exprese proběhlo pomocí denzitometrie autoradiogramů a...
|
|
Oprava poškození DNA vyvolaného sirným yperinem a jeho vztah k cytotoxicitě
Jílková, Martina ; Vopršalová, Marie (vedoucí práce) ; Herink, Josef (oponent)
SOUHRN Hlavním úkolem této práce bylo prostudovat indukci a následně mechanismus reparace poškození DNA sirným yperitem u specifických buněčných linií v dávkové závislosti a jejich vliv na cytotoxicitu yperitu. Yperit je zpuchýřující otravná látka, která může být zneužita v lokálních válečných konfliktech, při teroristických útocích nebo může dojít k náhodné expozici při likvidaci jeho zásob. Yperit vyvolává v interakci s buňkou závažné alkylační poškození DNA, které zahrnuje přímé zlomy vláken DNA, monoaddukty s adeninem a guaninem a vznik křížových vazeb interakcí s guaniny v obou komplementárních vláknech DNA.V této práci jsme se zaměřili na křížové vazby a k jejich detekci použili metodu buněčné gelové elektroforézy (Single Cell Gel Electrophoresis, SCGE).Tato metoda slouží k detekci zlomů DNA a její pomocí lze hodnotit poškození DNA jednotlivých buněk. V námi použité modifikaci metody jsme u analyzovaných buněk nejdříve indukovali standardní množství zlomů DNA styrenoxidem, neboť přítomné křížové vazby brání rozplétání DNA. Ke studiu mechanismů reparace specifického poškození DNA jsme s výhodou použili buněčné linie s jasně definovanými deficity v určitých fázích opravy DNA. Pro experimenty jsme použili linie ovariálních buněk křečíka čínského AA8 a jejich mutanty UV-5 deficitní v helikázové aktivitě a...
|
| |
|
Dědičnost barvy srsti u koní
Krejčová, Lucie ; Sedláková, Vladimíra (vedoucí práce) ; Hofmanová, Barbora (oponent)
Genetická stránka zbarvení koní je zajímavým tématem, jež je už dlouhou dobu předmětem mnoha výzkumů. Díky testům DNA bylo prokázáno, že původní koně byli hnědí nebo plaví a v důsledku změn podmínek prostředí i černí. V období domestikace se velmi rychle začaly rozšiřovat další barvy, čemuž napomohl lidský výběr. Barva srsti je kvalitativním znakem a podléhá Mendelovým zákonům, za jednotlivá zbarvení koní jsou tedy zodpovědné geny velkého účinku. Ke většině zbarvení je již přiřazen konkrétní gen a je identifikována mutace, která se na genu může nacházet a změnit tak fenotypový projev. Výjimku tvoří zbarvení white, roan a tobiano, o nichž je známo jen, že mají souvislost s KIT genem, zbarvení dun a leopard jsou zatím pouze přiřazena k chromozomům ECA8 a ECA1. Mutace na genech jsou různého charakteru, u genů MC1R, MATP, PMEL17 a SLC36A1 se jedná o změnu jediného nukleotidového páru a u genu EDNRB se jedná o dinukleotidovou mutaci. Mutace na ASIP genu je způsobena delecí 11 nukleotidových párů a naproti tomu je mutace genu STX17 zapříčiněna duplikací 4,6 kb. Poznání struktur genů a mutací je nezbytné pro testování zbarvení koní na molekulární úrovni. Testování DNA je stále v rozvoji, ale v současné době je již možno testovat koně na většinu barev, což má význam v přesné identifikaci barvy, ale i v zamezení rozvoji chorob, které se s některými genotypy pojí. Cílem této práce je utřídit a sjednotit informace o různých zbarveních koní a způsobu jejich dědičnosti, kvůli vzrůstajícímu zájmu lidí a chovatelů o tuto problematiku.
|
|
Histonový kód a jeho regulace během časného embryonálního vývoje prasete
Jelínková, Pavla ; Žalmanová, Tereza (vedoucí práce) ; Miriama, Miriama (oponent)
U samčího i samičího prvojádra zygoty dochází po oplození k epigenetickým změnám, od kterých se odvíjí kvalita zygoty a úspěšnost časného embryonálního vývoje savců. Mezi prvojádry zygoty je krátce po oplození patrná epigenetická asymetrie, kdy u samčího prvojádra probíhá aktivní demethylace DNA, zatímco DNA maternálního prvojádra zůstává methylováno. Navíc u samčího prvojádra dochází k procesu acetylace histonů chromatinu, zatímco genom samičího prvojádra si ponechává histony více methylované. Asymetrie prvojader a jejich epigenetický stav předvídá úspěšnost reprogramace genomu a tím úspěšnost embryonálního vývoje. Pro úspěšný vývoj embrya je tedy nezbytná správná formace obou prvojader zygoty, kterou regulují post-translační modifikace histonů utvářející tzv. histonový kód. Byla stanovena hypotéza, že tento histonový kód je regulován aktivitou NADP+-dependentních histon deacetyláz, sirtuinů.
V experimentu byly použity plně dorostlé prasečí oocyty, které byly po in vitro zrání oplozeny prasečími spermiemi. Po izolaci zygot, kultivovaných s přídavkem aktivátoru sirtuinů resveratrolu, byla provedena imunofluorescenční analýza přítomnosti acetylovaného a methylovaného histonu H3 na lyzinu K9 u prvojader zygoty. Z výsledků je u kontrolní skupiny patrná asymetrie mezi oběma prvojádry zygoty, kde samčí prvojádro vykazuje vyšší intenzitu acetylace a naproti tomu samičí prvojádro vyšší intenzitu methylovaného signálu. U všech pokusných skupin došlo po přídavku resveratrolu u samičího prvojádra k výraznému zvýšení intenzity signálu methylovaného histonu H3 na lyzinu K9 a naopak u prvojádra samčího k výraznému snížení intenzity signálu acetylovaného histonu H3 na lyzinu K9.
Sirtuiny jsou zapojeny do regulace histonového kódu v prasečí zygotě a lze se domnívat, že sehrávají také úlohu během dalšího embryonálního vývoje, což je předmětem dalšího studia.
|
|
Cytogenetické metody v genotoxikologii
Bártů, Linda ; Langová, Martina (oponent) ; Daňková, Pavlína (vedoucí práce)
Každý den jsme vystaveni vlivu řady faktorů, které mohou působit jako mutageny na naši DNA. Věda zkoumající vliv takovýchto mutagenních faktorů, které mohou být fyzikálního, chemického i biologického původu, se nazývá genotoxikologie. Mezi fyzikální faktory patří v první řadě ionizující záření. Z chemických můžeme zmínit např. benzen či vinylchlorid nebo některé léky. Jako biologické mutagenní faktory mohou působit některé viry. Opravné mechanismy buňky, které opravují dvouvláknové zlomy DNA, se liší dle toho, jestli vyžadují rozsáhlé homologní sekvence (HRR) nebo naopak, zda se bez takovýchto sekvencí obejdou a vystačí si jen s krátkými homologními sekvencemi zahrnujícími několik málo bazí (NHEJ). Oba tyto mechanismy, pokud neproběhnou správně, mohou vést ke vzniku aberací chromosomů. Mezi získané chromosomové aberace patří translokace, vyskytující se často u nádorových buněk, delece, nebo například vznik acentrických fragmentů, dicentrických a prstencových chromosomů. Chromosomové aberace zahrnují chromatidové zlomy a chromatidové výměny. Metody pro vyšetření takovýchto změn je několik, mohou být rozděleny podle fáze, ve které se vyskytuje buňka v době vyšetření. Nejzákladnější metodou je klasické barvení Giemsou, které odhalí většinu aberací, kromě translokací a inverzí, a numerické odchylky...
|
|
Molekulárně-dynamické simulace komplexů sestávajících z nukleových kyselin a proteinů
Hammer, Jiří ; Barvík, Ivan (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent)
Cílem této diplomové práce bylo studium interakcí proteinu Argonautu (Ago) s komplexy nukleových kyselin. Na základě krystalových struktur Argonautu (A. aeolicus, Aa-Ago) a popř. jeho domén (lidská PAZ doména, Hs-PAZ) bylo vyprodukováno dvanáct různých simulací. Prvé dvě využily modelu Aa-Ago s různými substráty: buď s DNA/RNA nebo RNA/RNA duplexem. Hlavní rozdíl byl pozorován při interakci PAZ domény (resp. jejích argininových reziduí), která tolerovala guide DNA, nikoli však guide RNA vlákno. To naznačuje možnou funkci PAZ domény při rozpoznávání duplexů RNA/RNA od hybridních duplexů DNA/RNA. V dalších simulacích (3-9) byla využita Hs-PAZ doména. Žádné konflikty s guide DNA vláknem nebyly pozorovány. Byla vyzkoušena různá uspořádání aktivního místa, počet iontů a jejich parametrizace. DD-katalytický motiv s D683 (ekviv. lidskému H807 z Ago2) koordinoval (jeden, popř. dva) ionty Mg2+. Vysoce konzervovaná rezidua R570 a E578 stabilizovala aktivní místo vzájemnou vodíkovou vazbou. Z hlediska nevratnosti procesu přeštípnutí mRNA může hrát důležitou úlohu první (nepárový) nukleotid z 5'-konce guide DNA. Tato úloha by spočívala v tvorbě vodíkového můstku s přeštípnutým vláknem mRNA vedoucí k jeho destabilizaci. Simulace (10-12) s homologními modely lidských Ago2 se ukázaly jako málo stabilní a věrohodné...
|
host ::
