|
|
Úloha sirtuinů během formace prvojader po in vitro oplození prasečích oocytů
Maryníková, Veronika ; Žalmanová, Tereza (vedoucí práce) ; Miriama , Miriama (oponent)
Význam reprodukčních biotechnologií v posledních letech nezadržitelně stoupá. Umožňují dosáhnout vyšší užitkovosti hospodářských zvířat či zdokonalení léčebných
postupů v humánní medicíně. Pro rozvoj reprodukčních biotechnologií je zapotřebí zajistit dostatečné množství vývojově kompetentních oocytů a následně zdravých životaschopných embryí pro kultivaci v in vitro podmínkách. Klíčovým momentem, který následuje krátce po
oplození, je formace prvojader. Zajištění správného histonového kódu je nezbytné pro správný vývoj raného embrya. Při poruše histonového kódu může dojít k vývojovým defektům až k zániku embrya. Jedním z mechanismů účastnících se regulace histonového
kódu, ke kterému se v posledních letech obrací pozornost, jsou NAD+-dependentní histon deacetylázy, známé také jako sirtuiny. Tuto skupinu deacetyláz tvoří sedm izoforem, SIRT1-7, z nichž SIRT1 se zdá být klíčovým pro regulaci časného embryonálního vývoje.
Na základě dosavadních poznatků byla stanovena hypotéza, že SIRT1 je přítomen v prasečích zygotách a je zde zapojen do regulace formace prvojader. Pro experiment byly použity prasečí COCs, které byly vystaveny 44 hod. in vitro zrání. Po ukončení kultivace byly vybrány zralé oocyty a tyto byly dále použity pro in vitro oplození. Zygoty byly kultivovány spolu s inhibitorem sirtuinů, nikotinamidem, či se specifickým inhibitorem SIRT1, sirtinolem. Po 22 hod. kultivace in vitro byly zygoty podrobeny imunocytochemické lokalizaci acetylovaného a metylovaného histonu H3 na lysinu 9 (K9) a analýze obrazu.
Ze získaných výsledků je patrné, že SIRT1 je přítomný v prasečích zygotách, kde je jeho lokalizace směřována především do prvojader. Po inhibici SIRT1 byly patrné změny na hladině acetylace a metylace H3K9, kdy došlo k signifikantnímu nárůstu acetylovaného H3K9 a naopak poklesu methylovaného H3K9. Použití sirtinolu potvrdilo, že tyto změny histonového kódu způsobuje zejména SIRT1. Zapojení SIRT1 do regulace histonového kódu ve fázi formace prvojader prasat je však neuspokojivě probádaná oblast výzkumu, která vyžaduje podrobnější objasnění mechanismů účinků.
|
|
|
Histonový kód a jeho regulace během časného embryonálního vývoje prasete
Jelínková, Pavla ; Žalmanová, Tereza (vedoucí práce) ; Miriama, Miriama (oponent)
U samčího i samičího prvojádra zygoty dochází po oplození k epigenetickým změnám, od kterých se odvíjí kvalita zygoty a úspěšnost časného embryonálního vývoje savců. Mezi prvojádry zygoty je krátce po oplození patrná epigenetická asymetrie, kdy u samčího prvojádra probíhá aktivní demethylace DNA, zatímco DNA maternálního prvojádra zůstává methylováno. Navíc u samčího prvojádra dochází k procesu acetylace histonů chromatinu, zatímco genom samičího prvojádra si ponechává histony více methylované. Asymetrie prvojader a jejich epigenetický stav předvídá úspěšnost reprogramace genomu a tím úspěšnost embryonálního vývoje. Pro úspěšný vývoj embrya je tedy nezbytná správná formace obou prvojader zygoty, kterou regulují post-translační modifikace histonů utvářející tzv. histonový kód. Byla stanovena hypotéza, že tento histonový kód je regulován aktivitou NADP+-dependentních histon deacetyláz, sirtuinů.
V experimentu byly použity plně dorostlé prasečí oocyty, které byly po in vitro zrání oplozeny prasečími spermiemi. Po izolaci zygot, kultivovaných s přídavkem aktivátoru sirtuinů resveratrolu, byla provedena imunofluorescenční analýza přítomnosti acetylovaného a methylovaného histonu H3 na lyzinu K9 u prvojader zygoty. Z výsledků je u kontrolní skupiny patrná asymetrie mezi oběma prvojádry zygoty, kde samčí prvojádro vykazuje vyšší intenzitu acetylace a naproti tomu samičí prvojádro vyšší intenzitu methylovaného signálu. U všech pokusných skupin došlo po přídavku resveratrolu u samičího prvojádra k výraznému zvýšení intenzity signálu methylovaného histonu H3 na lyzinu K9 a naopak u prvojádra samčího k výraznému snížení intenzity signálu acetylovaného histonu H3 na lyzinu K9.
Sirtuiny jsou zapojeny do regulace histonového kódu v prasečí zygotě a lze se domnívat, že sehrávají také úlohu během dalšího embryonálního vývoje, což je předmětem dalšího studia.
|
host ::
RSS.