|
|
Rekombinantní příprava DNA vazebné domény transkripčního faktoru TEAD1 pro studium jeho interakcí s DNA
Kúdelová, Veronika ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Dračínská, Helena (oponent)
Proteiny TEAD patří do významné rodiny transkripčních faktorů, které se během vývoje organismu podílí na regulaci jeho růstu a diferenciace buněk prostřednictvím aktivace exprese nejrůznějších genů. Tato rodina sdílí dvě vysoce konzervovaná místa, a to TEA DNA vazebnou doménu, po které tyto proteiny získaly název, a doménu, pomocí níž transkripční faktory váží další koaktivátory. Protože TEAD proteiny nejsou samy o sobě schopné transkripce, interagují s řadou koaktivátorů, které umožňují regulovat transkripci požadovaného genu. Poruchou regulace aktivity TEAD proteinů může docházet ke vzniku nádorových onemocnění. Proto v dnešní době hrají proteiny rodiny TEAD nemalou roli při vývoji nových protinádorových léčiv. Jedním ze způsobů inhibice těchto proteinů je zabránění jejich vazbě na DNA, tedy blokace aktivního místa v DNA vazebné doméně. Tato bakalářská práce se zabývá rekombinantní expresí zmíněné DNA vazebné domény transkripčního faktoru TEAD1, která je prodloužená o aminokyseliny v nestrukturované oblasti. Po nalezení vhodných podmínek produkce bylo přistoupeno k produkci ve velkém objemu následované purifikací a ověřením identity proteinu. Nakonec byla potvrzena schopnost interakce produkovaného proteinu s DNA. Připravený protein bude tedy možné využít ke studiu způsobů jeho interakce s DNA,...
|
|
|
Model pro studium regulace transkripce granulocytarních genů MPO a MMP9 rozdílnými koncentracemi transkripčního faktoru PU.1
Chramostová, Kamila ; Pospíšil, Vít (vedoucí práce) ; Kleibl, Zdeněk (oponent)
7 Abstrakt Enhancery jsou distální cis - regulační sekvence DNA, které regulují (zesilují) transkripci genu řízenou z promotoru. Enhancery se nacházejí v nekódující DNA před, či za genem nebo v intronech či kódujících oblastech vzdálených až mnoho kilobází od genu. Superenhancery jsou nově objevená seskupení mnohočetných enhancerů, které hrají zásadní úlohu při aktivaci tkáňově specifických genů, určení buněčné identity a indukci diferenciace. PU.1 je transkripční faktor (TF) nezbytný pro normální krvetvorbu, konkrétně pro vývoj myeloidní a lymfoidní krevní řady. Přesná koncentrace PU.1 je zodpovědná za diferenciaci krvetvorných buněk do odlišných buněčných linií a jejich narušení vede k leukemogenezi. Vysoké koncentrace PU.1 stimulují makrofágový vývoj, zatímco střední koncentrace stimulují vývoj granulocytů. Jakými regulačními mechanismy je zajištěno, že granulocytární geny jsou aktivovány výhradně ve střední koncentrací PU.1, zatímco makrofágové ve vysoké, je zajímavá biologická otázka, k jejímuž zodpovězení se snaží přispět i tato diplomová práce. Cílem této diplomové práce bylo vytvořit sérii reportérových vektorů nesoucí regulační oblasti granulocytárních genů MPO a MMP9, které by umožnily studium mechanismů, jak jsou různé koncentrace TF PU.1 vnímány regulačními sekvencemi cílových genů. Na základě...
|
|
|
Regulation of expression of Ms1, a sRNA from Mycobacterium smegmatis
Páleníková, Petra ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent)
V průběhu růstu musí bakterie čelit různým vlivům prostředí, jako jsou změna teploty, nedostatek živin a jiné. Při adaptaci na nepříznivé podmínky dochází u bakterií k přizpůsobení genové exprese. Jedním typem regulace genové exprese je regulace pomocí malých nekódujících RNA (sRNA). Dobře studovanou bakteriální sRNA je 6S RNA, která se váže na holoenzym RNA polymerázy. Avšak tato RNA byla nalezena jen u některých druhů baterií. Jedním z druhů, které pravděpodobně nemají 6S RNA jsou mykobakterie. Místo toho byla u Mycobacterium smegmatis nalezena jiná malá RNA - Ms1. Ms1 má strukturu podobnou 6S RNA a skutečně byla původně nalezena jako strukturní homolog 6S RNA. Ukázalo se však, že Ms1 se neváže na holoenzym RNA polymerázy, ale váže se na jádro RNA polymerázy. Jedná se proto o malou RNA významně odlišnou od 6S RNA. Tato práce popisuje regulaci exprese Ms1. Z regulační oblasti před genem pro Ms1 byli připraveny promotorové fragmenty různé délky. Tyto fragmenty byly vloženy před reportérový gen lacZ. Aktivita těchto promotorů byla testována v exponenciální, časné a pozdní stacionární fázi růstu a v průběhu stresu. Na základě provedených experimentů byla určena sekvence promotorového jádra a regulační oblasti, do kterých by se mohl vázat transkripční faktor. Aktivita promotoru pro Ms1 se zvýšila při...
|
|
|
Regulatory mechanisms of ornithin transcarbamylase and beta-glucocerebrosidase gene expression and their relevance to diagnostics
Lukšan, Ondřej ; Jirsa, Milan (vedoucí práce) ; Kožich, Viktor (oponent) ; Kříž, Vítězslav (oponent)
4 Abstrakt Konečná diagnóza d dičných metabolických poruch je obvykle určena na základ vyšet ení enzymové aktivity (což je mnohdy komplikované) a/nebo za pomoci molekulárn genetického vyšet ení. Výsledky standardní mutační analýzy však mohou být n kdy zavád jící, zejména v p ípad rozsáhlých reorganizací na úrovni chromozomu či u mutací v regulačních oblastech. P edkládaná práce je zam ena na charakterizaci komplexních mutací v genu pro ornitin transkarbamylázu (OTC), studium regulačních oblastí OTC a genu pro β-galaktozidázu (GBA). V rámci studie provedené na souboru čítajícím 37 pacient s kongenitální hyperamonémií II. typu (OTCD) bylo identifikováno a charakterizováno 14 nových mutací včetn t í rozsáhlých delecí. Byl zaznamenán i p ípad symptomatické heterozygotky pro hypomorfní mutaci p.R129H, u níž byl fenotyp OTCD z ejm podmín n posunem v X-inaktivaci ve prosp ch mutované alely. Nález byl podložen sledováním nevýhodné X-inaktivace ve t ech r zných periferních tkáních. Za účelem prov ení patogenity promotorové variace c.-366A>G v OTC nalezené v jedné rodin s mírným fenotypem OTCD byly identifikovány t i alternativní počátky transkripce (PT) a vymezen promotor lidského OTC. Transkripční aktivita promotoru, stejn tak jako aktivita nov nalezeného distálního enhanceru, byla ov ena funkční esejí. Výsledky...
|
|
|
Molekulární mechanismy v diabetické embryopatii
Čerychová, Radka ; Pavlínková, Gabriela (vedoucí práce) ; Kolář, František (oponent)
Diabetická embryopatie je jednou z vážných komplikací spojených s diabetem. Je známo, že maternální diabetes zvyšuje četnost vrozených defektů až desetkrát. Nejčastějšími defekty jsou kardiovaskulární defekty a defekty neurální trubice. Molekulární mechanismy vzniku diabetické embryopatie stále nejsou známy. Tato práce přispívá k objasnění molekulárních procesů vedoucích ke vzniku kardiovaskulárních defektů v diabetické embryopatii. Studie vychází ze zjištění, že maternální diabetes ovlivňuje transkripční regulaci hypoxií indukovaného faktoru 1 (HIF-1) ve vyvíjejícím se embryu. Pro studium vlivu maternálního diabetu na HIF-1 signální dráhu byl použit myší model heterozygotní pro "knock-out" Hif1α genu. Analýzy ukázaly negativní vliv maternálního diabetu na vývoj embrya a vyšší riziko vzniku diabetické embryopatie u Hif1α+/- mutantů v porovnání s wt embryi vystavenými diabetickému prostředí. Histologická analýza defektů srdcí v embryonálním dni (E) 14,5 potvrdila zvýšený výskyt kardiovaskulárních defektů, zejména defektů mezikomorového septa a hypoplasii kompaktní stěny levé komory u Hif1α+/- embryí ve srovnání s wt embryi z diabetických těhotenství. Pro lepší porozumění molekulárních změn byly provedeny qPCR analýzy genové exprese v embryonálním srdci ve věku E9,5 a E10,5. Pro studium změn exprese...
|
|
|
Studium exprese jaderného receptoru nhr-97 v Caenorhabditis elegans
Boušová, Kristýna ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Vaněk, Ondřej (oponent)
Jaderné hormonální receptory (NHR) patří mezi důležité transkripční faktory, které regulují vývoj a metabolismus u velké části živočichů. Caenorhabditis elegans obsahuje 284 jaderných receptorů, což je neobvykle velké množství oproti receptorům nalezeným u Drosophila melanogaster (18) a u člověka (48). Patnáct z těchoto receptorů C. elegans má homologní strukturu s receptory D. melanogaster a se savci. Zbylých 269 NHR jsou specifické pouze pro hlístice a patří do skupiny tzv. doplňkových jaderných receptorů (SupNRs), jejichž evolučním předchůdcem je HNF4 - důležitý transkripční faktor u člověka. V této práci jsme popsali jaderný hormonální receptor nhr-97, jehož exprese a funkce dosud nebyly studovány. Gen je kódován v genomu C. elegans a patří mezi SupNRs. Nhr-97 tvoří dvě isoformy A a B, jejichž exprese je v tkáních C. elegans odlišná. Lokalizace exprese genu in vivo byla určena pomocí transgenních linií exprimujících nhr-97::GFP. Pro isoformu A byla exprese nhr-97 lokalizována v neuronech v oblasti hltanu a v oblasti ocásku, ve střevě a v hypodermis, pro isoformu B v hltanu, v neuronech okolo korpusu hltanu, v hlavové mesodermální buňce a v análním svěrači. Exprese nhr-97 během vývoje C. elegans byla stanovena pomocí kvantitativní polymerázové řetězové reakce (qPCR). Zjistili jsme, že mRNA...
|
|
|
Studium vlivu genu yxkO Bacillus subtilis na motilitu během odpovědi na osmotický stres.
Streitová, Eliška ; Lichá, Irena (vedoucí práce) ; Krásný, Libor (oponent)
Bacillus subtilis je gram-pozitivní půdní bakterie. Ve svém přirozeném prostředí je neustále vystavena změnám chemických a fyzikálních podmínek, včetně změn osmolality. Buňka reaguje na zvýšení osmolality prostředí příjmem draselných iontů a následně transportem a/nebo syntézou kompatibilních solutů. V předchozích letech byl v naší laboratoři s využitím nespecifické inzerční mutageneze (mini Tn10) izolován a charakterizován kmen Bacillus subtilis L-42. Tento kmen vykazuje sníženou schopnost růstu a osmolabilitu na médiích s koncentrací draselných iontů < 1 mmol/l. Inzercí transpozonu došlo k přerušení genu yxkO kódujícího protein prozatím neznámé funkce. Další výsledky získané v naší laboratoři navíc naznačovaly možný vliv přerušení genu yxkO na expresi genu hag kódujícího protein flagelin - majoritní protein vlákna bakteriálního bičíku. Cílem této diplomové práce bylo objasnit, zda přerušení genu yxkO ovlivňuje motilitu, a zda je ovlivněna exprese genu hag na transkripční úrovni. S využitím integračního vektoru pMUTIN4 byl připraven mutantní kmen se specificky zavedenou mutací v genu yxkO v kmeni Bacillus subtilis 1A839, jehož genotyp zajišťuje vyloučení známé transkripční regulace genu hag. Následně byla sledována motilita buněk s využitím světelné a elektronové mikroskopie. Získané výsledky...
|
|
|
DNA vazebné vlastnosti proteinů rodiny CSL ve Schizosaccharomyces pombe
Ptáčková, Martina ; Půta, František (vedoucí práce) ; Doležal, Pavel (oponent)
Transkripční faktory rodiny CSL (CBF1/RBP-Jκ/Suppressor of Hairless/Lag-1) jsou jako výkonná složka signální kaskády Notch podstatné pro mnohé vývojové procesy metazoálních organismů, ale mohou působit také nezávisle na Notch. V nedávné době byla jejich přítomnost prokázána v houbových organismech, které postrádají signalizaci Notch a také většinu známých metazoálních interakčních partnerů. Proteiny CSL jednobuněčné kvasinky Schizosaccharomyces pombe, Cbf11 a Cbf12, byly experimentálně určeny jako neesenciální jaderné transkripční faktory, které antagonistickým způsobem regulují buněčnou adhezi, produkci extracelulárního materiálu, morfologii kolonií, septaci a oddělování dceřiných buněk, koordinaci jaderného a buněčného dělení a udržování ploidie. Responzivní geny těchto faktorů dosud nejsou známé. V této práci byly predikovány geny S. pombe, jejichž promotorové oblasti představují možné přímé cíle pro vazbu proteinů Cbf. Vazba proteinů Cbf11, Cbf12 a také zkráceniny Cbf12∆N na vazebné elementy pro faktory CSL obsažené v regulačních oblastech vybraných genů S. pombe byla testována in vitro metodou EMSA a následně v případě proteinu Cbf11 in vivo metodou ChIP. Proteiny Cbf11 a Cbf12∆N sekvenčně specificky rozpoznávají vazebné elementy in vitro, ale jejich afinita, stejně tak jako jejich vazebné...
|
|
|
Regulace transkripce mikroRNA klastru miR-17-92 v průběhu diferenciace makrofágů.
Rybářová, Jana ; Stopka, Tomáš (vedoucí práce) ; Pospíšek, Martin (oponent)
miR-17-92 klastr (Oncomir1) kóduje sedm mikroRNA (miRNA, miR) regulujících řadu biologických procesů jako je proliferace, diferenciace nebo apoptóza. Zvýšená exprese mikroRNA kódovaných tímto klastrem byla zjištěna u řady nádorových onemocnění včetně akutní a chronické myeloidní leukémie (Dixon-McIver et al., 2008; Li et al., 2008; Venturini et al., 2007). Myeloidní progenitory významně exprimují miR-17-92 klastr, zatímco makrofágová diferenciace je doprovázena výrazným snížením jeho exprese. V naší laboratoři bylo prokázáno, že miR-17-92 klastr je během diferenciace primárních PUER myeloidních progenitorů indukovaných transkripčním faktorem PU.1 (SPI1) reprimován transkripčním faktorem Early growth response 2 (Egr2). Cílem této diplomové práce bylo vytvořit sérii reportérových vektorů nesoucích fragmenty miR-17-92 putativního promotoru, které by umožnily studium regulace transkripce miR-17-92 klastru. Výsledně se podařilo připravit 8 fragmentů obsahujících různé úseky regulační oblasti miR-17-92 klastru v rozsahu -3.3 až 0 kb vzhledem ke kódující oblasti miR-17-5p, a to i přes vysoký CG obsah (~80%), které byly následně vklonovány do pGL3 reporterového vektoru. Transfekce a následná funkční esej pGL3 reporterového vektoru nesoucího -3.3;-0kb fragment putativního promotoru miR-17-92 v buňkách...
|
|
|
The molecular mechanism of CSL protein participation in oxidative stress response in Schizosaccharomyces pombe
Daněk, Petr ; Převorovský, Martin (vedoucí práce) ; Sipiczki, Matthias (oponent)
Pro správné fungování organismu je nezbytné udržovat v jeho buňkách vyvážený redoxní stav, neboť zatímco relativně nízká koncentrace volných kyslíkových radikálů je třeba pro adekvátní transdukci signálů, vyšší koncentrace těchto molekul (oxidativní stres) má prokazatelně škodlivé účinky a je spojena s řadou patologických stavů a onemocnění. Z tohoto důvodu se v buňkách během evoluce vyvinula široká škála vysoce konzervovaných antioxidačních mechanismů. Byly zevrubně popsány rozsáhlé a složité interakční vztahy mezi signálními proteiny a drahami regulujícími odpověď na oxidativní stres, nicméně naše znalost odpovědi na oxidativní stres ještě není kompletní a stále jsou objevovány nové regulační proteiny a mechanismy. Výsledky několika současných vědeckých prací ukazují, že se transkripční faktory patřící do proteinové rodiny CSL, které jsou nezbytné zejména pro embryonální vývoj metazoí jako efektory signální dráhy Notch, mohou na regulaci odpovědi na oxidativní stres také podílet. Poltivá kvasinka Schizosaccharomyces pombe, hojně používaný a pro studium buněčných odpovědí na stresové podněty dobře etablovaný modelový organismus, obsahuje dva paralogy transkripčních faktorů CSL, nazvané Cbf11 a Cbf12. Naše laboratoř ukázala, že buňky s delecí genu cbf11 jsou vysoce rezistentní vůči peroxidu vodíku....
|
host ::
RSS.