|
|
Oxidační poškození buněčných komponent po indukci oxidačního stresu specifickými herbicidy
Kramná, Barbara ; Wilhelmová, Naďa (vedoucí práce) ; Ryšlavá, Helena (oponent)
1. Abstrakt Oxidační stres je způsoben nadměrnou produkcí a akumulací ROS (reaktivních forem kyslíku) a je častým důvodem buněčného poškození za nepříznivých environmentálních podmínek, např. za sucha, chladu, zasolení. Ve své práci jsem využila specifického působení herbicidů MV (methyl viologen) a 3-AT (3-aminotriazol) k přímé indukci oxidačního stresu u rostlin tabáku (Nicotiana tabacum cv. Xanthi). Míra oxidačního poškození byla sledována na úrovni DNA pomocí kometového testu, dále na peroxidaci lipidů, hladině karbonylovaných proteinů a modifikaci aktivit antioxidačních enzymů CAT (katalázy) a APX (askorbátperoxidázy). Konfokální fluorescenční mikroskopie zdokumentovala změnu redoxního stavu buněk po aplikaci herbicidů a při vyšších koncentracích byl pozorovaný signál specificky lokalizován do peroxizómů. Použité herbicidy působily v řádově odlišných koncentracích, MV v µM a 3-AT v mM a oba způsobily výrazné poškození jaderné DNA. Jako další průkazný marker oxidačního stresu po aplikaci MV se ukázala být karbonylace proteinů. Inhibice antioxidačních enzymů CAT a APX byla oproti 3-AT méně výrazná. Klesající stabilita membrán se ukázala být univerzálním markerem oxidačního poškození pro oba herbicidy, zatímco peroxidace lipidů byla neprůkazná. MV a 3-AT mají rozdílné módy účinku, a každý působí na...
|
|
|
Úloha mitochondrií v adaptaci na chronickou hypoxii u spontánně hypertenzních a konplastických potkanů
Weissová, Romana ; Kalous, Martin (vedoucí práce) ; Rauchová, Hana (oponent)
Adaptace na chronickou hypoxii má kardioprotektivní účinky. Molekulární mechanismus tohoto jevu není zatím zcela objasněn, je však prokázáno, že významnou úlohu v ochraně srdeční tkáně mají mitochondrie. V této diplomové práci byl zkoumán vliv adaptace na kontinuální normobarickou hypoxii (CNH; 10 % O2, 21 dní) na spontánně hypertenzní potkany (SHR) a od nich odvozený konplastický kmen, který má jaderný genom kmene SHR a mitochondriální genom kmene Brown Norway (BN). V homogenátu srdeční svaloviny normoxických a adaptovaných jedinců byly stanoveny enzymové aktivity malátdehydrogenázy (MDH), citrátsyntázy (CS), NADH-cytochrom c oxidoreduktázy, sukcinát-cytochrom c oxidoreduktázy a cytochromoxidázy (COX). Metodou Western blotu bylo stanoveno množství antioxidačních enzymů manganové a měď-zinkové superoxiddismutázy (MnSOD, Cu/ZnSOD), katalázy a vybraných podjednotek komplexů oxidační fosforylace (Ndufa9, Sdha, Uqcrc2, COX-4, MTCO1, Atp5a1). Konplastický kmen se od kmene SHR liší za normoxických podmínek pouze nižším množstvím podjednotky MTCO1 komplexu IV oxidační fosforylace. Podjednotka MTCO1 je kódovaná mitochondriální DNA a je produktem jednoho ze sedmi protein-kódujících genů, kterými se od sebe liší SHR a konplastický kmen. Po hypoxické adaptaci se zvyšuje množství katalázy a snižuje se množství...
|
|
|
Vliv chronické hypoxie na antioxidační kapacitu myokardu potkana.
Závišková, Kristýna ; Nováková, Olga (vedoucí práce) ; Žurmanová, Jitka (oponent)
Adaptace na chronickou hypoxii aktivuje endogenní signální dráhy vedoucí ke zvýšené odolnosti srdce k akutnímu ischemicko/reperfúznímu (I/R) poškození. Molekulární mechanismus tohoto jevu není zatím zcela objasněn. Bylo však prokázáno, že se v signální dráze kardioprotekce indukované chronickou hypoxií uplatňují reaktivní formy kyslíku (ROS), jejichž zvýšená hladina musí být přísně regulována antioxidačním systémem buňky. Cílem diplomové práce bylo sledovat vliv intermitentní hypobarické hypoxie (IHH, 7 000 m) na relativní zastoupení antioxidačních enzymů (peroxiredoxin 6 - PRX6, thioredoxin 1 a 2 - TRX1 a TRX2, thioredoxinreduktáza 1 - TRXR1) a rovněž enzymů metabolismu železa (hemoxygenáza 1 a 2 - HO1 a HO2, akonitáza 1 a 2 - ACO1 a ACO2), které se podílí na regulaci redoxního stavu buňky. Současně jsme stanovili vliv adaptace na IHH a antioxidantu tempolu na relativní množství na kalciu nezávislé fosfolipázy A2 (iPLA2). iPLA2 se jednak podílí na odstraňování peroxidovaných mastných kyselin z membránových fosfolipidů, na druhou stranu za I/R podmínek buňku spíše poškozují. Všechny enzymy byly stanoveny metodou Western blot v homogenátu z normoxického a na IHH adaptovaného myokardu levé komory potkana. Zjistili jsme, že se po adaptaci na IHH snižuje relativní množství PRX6 a naopak se zvyšuje množství TRX1...
|
|
|
Faktory ovlivňující příjem a distribuci uranu v rostlinách
Krejčová, Daniela ; Lhotáková, Zuzana (vedoucí práce) ; Tylová, Edita (oponent)
Uran je radionuklid, který se v malém množství přirozeně vyskytuje v zemské kůře. V těchto koncentracích není příliš nebezpečný, ale jeho koncentrace se kvůli antropogenní činnosti zvyšuje a dá se očekávat, že i v budoucnosti bude jeho množství narůstat. Proto je nutné zkoumat možnosti, jak takovouto kontaminaci co nejšetrněji a zároveň efektivně odstranit. Vhodným řešením by mohla být fytoremediace, ale tato metoda je v případě kontaminace uranem relativně na začátku. Proto je třeba studovat vliv uranu na rostliny a zjistit, nakolik jsou vhodné pro fytoremediaci uranem kontaminovaných areálů. Fytoremediační metody jsou založené na schopnosti rostlin přijímat a akumulovat dané polutanty. Nejzásadnější faktory ovlivňující příjem uranu rostlinou se dají v zásadě rozdělit do čtyř skupin: druh rostliny, oxidační stav uranu, pH média nebo substrátu a ligand, který je na uran navázán (Mitchell, 2013). S tím úzce souvisí i transport uranu do nadzemních částí rostliny. Rostliny se musí s přijatým uranem vypořádat; kromě radiologického rizika vyplývajícího z vlastností radioizotopu, je uran zároveň i těžký kov. Pro rostliny je výrazně závažnější chemická toxicita uranu způsobující mimo jiné oxidativní stres, než radioaktivita uranu. Informace o působení uranu na rostliny jsou velmi důležité pro další rozvoj...
|
|
|
Antioxidant enzymes response to abiotic stress. Impact of decreased cytokinin level.
Lubovská, Zuzana ; Wilhelmová, Naďa (vedoucí práce) ; Prášil, Ilja (oponent) ; Kočová, Marie (oponent)
Univerzita Karlova v Praze, Přírodovědecká fakulta Katedra experimentální biologie rostlin Doktorský studijní program: Fyziologie a anatomie rostlin Abstarakt Odpověď antioxidačních enzymů na abiotický stress. Vliv snížené hladiny cytokininů. Zuzana Lubovská Supervisor: RNDr. Naďa Wilhelmová, CSc. Supervisor-consultant: RNDr. Helena Štorchová, CSc. Praha, 2015 V rostlinách tabáku se sníženou hladinou cytokininů (CK) jsem sledovala odpověď antioxidačního enzymatického systému vyvolanou suchem, horkem a kombinací těchto stresorů. Byly použity dvě transgenní linie se sníženou hladinou CK díky overexpresi cytokininoxidasy/dehydrogenasy, genu kódující enzym pro degradaci CK, pod promotorem WRKY6 aktivním v kořenech (linie W6:CKX1) nebo pod konstitutivním promotorem 35S (linie 35S:CKX1) a netransformované rostliny (WT). U rostlin overexprimujících CKX1 se vyvinul větší kořenový system, který přispěl k jejich zvýšené toleranci vůči stresu. Rostliny 35S:CKX1 za sucha také zvýhodnil jejich zakrslý fenotyp a změněná morfologie listu. Geny kódující chloroplastové antioxidační enzymy, stromatální askorbátperoxidasa (sAPX), tylakoidní askorbátperoxidasa (tAPX) a chloroplastová superoxiddismutasa (FeSOD), které odklízejí reaktivní formy kyslíku pocházející z fotosyntetického elektrontransportního řetězce, byly všechny za...
|
|
|
Vliv akumulace manganu na vybrané rostliny
Švec, Pavel
Předkládaná práce se zabývá studiem vlivu vysokých dávek manganu na kulturní plodiny (Brassica napus, Hordeum vulgare, Zea mays), bylinku Matricaria chamomilla a sladkovodní mikrořasu Scenedesmus quadricauda. Především byl sledován růst, aktivita vybraných antioxidačních enzymů a obsah sekundárních metabolitů. Zjistili jsme, že vysoké dávky manganu zpomalují růst, což mělo za následek snížení biomasy, které jsme pozorovali u všech testovaných rostlin s výjimkou řas. Mangan se akumuluje v kořenech a část přijatého manganu se transportuje do nadzemní části rostlin. Jedná se o rovnoměrnější rozložení tohoto kovu v rostlině v porovnání například s mědí nebo kadmiem. Zaznamenali jsme změny v obsahu alifatických organických kyselin a v množství celkových thiolů. Byla zaznamenána zvýšená aktivita některých antioxidačních enzymů v závislosti na druhu rostliny. Nadbytek manganu měl toxičtější účinky na řepku než na ontogeneticky starší heřmánek lékařský, který vykazoval vyšší toleranci vůči vysokým dávkám manganu. Také jsme zjistili, že na toxicitu manganu má pozitivní vliv oxid dusnatý, který zlepšuje stav rostlin. Toto zlepšení se projevilo snížením množství přijatého manganu, snížením tvorby ROS, snížením lipidové peroxidace a zlepšením růstových parametrů testovaných rostlin. Hodnota pH má vliv na dostupnost manganu, ale neovlivňuje příjem manganu rostlinami. Také jsme zjistili, že kompetice Mn2+ a Ca2+ probíhá nejen u vyšších rostlin, ale i u sladkovodní mikrořasy Scenedesmus quadricauda.
|
|
|
Changes of the intracellular redox state during virus infections
Kompas, Maroš ; Mělková, Zora (vedoucí práce) ; Trejbalová, Kateřina (oponent)
Vírusy predstavujú infekčné agens, v súvislosti s ktorými dochádza k narušeniu redoxnej homeostázy hostiteľských buniek. Tento efekt je daný buď výsledkom odpovede hostiteľskej bunky na infekciu, alebo prostredníctvom génových produktov vírusu. Pri narušení redoxnej homeostázy dochádza k aktivácií bunkovej adaptívnej odpovede na oxidatívny stres pomocou Nrf2, výsledkom čoho je posilnená exprimácia antioxidačných enzýmov, ktorých úlohou je navrátiť redoxné prostredie bunky na fyziologické hodnoty. Za suboptimálnych redoxných podmienok, alebo za predpokladu, že v bunke bola detegovaná prítomnosť cudzorodej nukleovej kyseliny, rovnako dochádza k aktivácií redoxne senzitívneho transkripčného faktora Nf-κB. To vedie k aktivácií expresie mediátorov imunitných odpovedí, ktoré majú pri dlhodobých zápaloch nepriaznivé účinky na okolité tkanivá. Túto skutočnosť využívajú vírusy, ktoré si v procese evolúcie vyvinuli prostriedky, vďaka ktorým dokážu zneužiť či zablokovať tieto dráhy, výsledkom čoho dochádza k propagácií infekcie. Kľúčové slová: redoxný stav bunky, ROS, RNS, oxidatívny stres, antioxidační enzýmy, regulácia génovej expresie, vírusové infekcie
|
|
|
Vliv herbicidu s-metolachloru na raná vývojová stádia raka mramorovaného
MATERNA, Jan
S-metolachlor je látka patřící do skupiny herbicidů, které jsou v současné době používány k ochraně zemědělských plodin. Konkrétně je tato látka s chemickým názvem C15H22CINO2 řazena mezi preemergentní herbicidy používané k potlačení nežádoucích plevelných rostlin. Cílem této práce bylo posouzení vlivu s-metolachloru na mortalitu, chování, růst, ontogenetický vývoj, hladinu oxidativního stresu a aktivitu antioxidačních enzymů raných vývojových stádií raka mramorovaného (Procambarus fallax f. virginalis). Vliv tohoto herbicidu byl hodnocen na základě embryolarválního test toxicity na racích. Raná vývojová stádia raků byla vystavena třem koncentracím s-metolachloru a to 1,1 mikrogramů/l, 11 mikrogramů/l a 110 mikrogramů/l po dobu 45 dnů. U všech testovaných koncentrací byla prokázána vyšší mortalita, zpoždění ontogenetického vývoje s doprovodným pomalejším růstem a změny v chování (celková pohybová vzdálenost a rychlost chůze). Navíc bylo pozorováno významné snížení koncentrace katalázy, glutathion S-transferázy, superoxid dismutázy a snížení hladiny redukovaného glutathionu ve dvou vyšších testovaných koncentracích (11 mikrogramů/l a 110 mikrogramů/l) s-metolachloru ve srovnání s kontrolou. U žádné z testovaných skupin nebyly pozorovány statisticky významné změny v oxidačním poškozením (hladině TBARS). Na základě výsledků této studie lze doporučit raná vývojová stádia raků jako vhodné organismy pro testy toxicity a jejich využití pro biomonitoring zatížení vodního prostředí herbicidy.
|
|
|
Teplotní závislost motility spermatu u různých druhů ryb
DADRAS ASYABAR, Hadiseh
Reprodukce ryb ať už v přirozených nebo kontrolovaných podmínkách akvakultury je biologickou záležitostí, která může být silně svázána s reprodukčním úspěchem. Navíc, studium fyziologie spermatu a kontrola kvality spermií může být brána v potaz jakožto nástroj umožňující úspěšnou produkci v akvakulturních systémech. Často se připouští, že kvalita spermatu jakožto jeden z limitujících faktorů reprodukčního úspěchu je ovlivňována různými faktory, proto některé výzkumy věnují pozornost kvalitě spermatu. Motilita je považována za jeden z nejspolehlivějších parametrů pro predikci kvality spermatu a pro zhodnocení oplozovacího potenciálu spermatu se běžně používá pozorování snížení motility spermatu za in vitro a in vivo podmínek. Tyto studie byly provedeny na základě hypotézy, která má za cíl vyhodnotit charakteristiky motility spermií a některé fyziologické změny spermatu (jako je aktivita antioxidačních enzymů a složení lipidů) v rozmezí výtěrové teploty každého druhu. Bylo provedeno zjištění funkce motility rybích spermií a enzymatické odezvy ve vztahu k různým in vitro teplotám s použitím aktivace spermií u taxonomicky vzdálených druhů ryb (kapr obecný, pstruh duhový a jeseter malý) při 4, 14 a 24 ° C. Speciální pozornost byla věnována parametrům motility spermií (rychlost, trvání a velocita), aktivitě katalázy (CAT) a superoxidu dismutázy (SOD) a látkám reagujícím s kyselinou thiobarbiturovou (TBARS) jakožto ukazatelům peroxidace lipidů. Výsledky studie ukazují, že trvání motility u tří výše zmíněných druhů je nejdelší ve 4°C ve srovnání s 14 a 24°C. U pstruha duhového a kapra byla signifikantně zvýšená velocita při 14°C po 10 a 30s od aktivace spermatu. Zatímco po 60s po aktivaci byla nejvyšší velocita u jesetera malého při 24°C. Aktivita CAT byla nejvyšší při 4°C u pstruha duhového a jesetera malého, zatímco u kapra nebyl pozorován žádný rozdíl. Jakožto další cíl studie byl analyzován obsah lipidů mezi pohyblivým a nepohyblivým kapřím spermatem za různých in vitro teplot (4, 14 a 24°C). Nejnižší obsah některých mastných kyselin 18:3 (n-3) a 22:6 (n-3) u pohyblivého spermatu byl detekován ve 24°C. Vzhledem k významu fosfolipidů jakožto zdroje energie pro pohyb spermatu, celkový obsah fosfolipidů byl nižší u pohyblivého než u nepohyblivého spermatu ve 24°C. Poměry phosphatidylcholinu and phosphatidylserinu byly nižší u pohyblivého než u nepohyblivého spermatu. Na základě těchto dat lze říci, že obsah lipidů u pohyblivého spermatu kapra je ovlivňován teplotou, sníženým poměrem některých lipidových částí při vyšší teplotě, zvýšením velocity a sníženým trváním periody, po kterou je udržována motilita. Třetí studie byla navržená, aby zkoumala úlohu různých faktorů, které by mohly ovlivnit aktivaci motility spermií s využitím fyziologických funkcí osmolality, iontů vápníku (Ca2+) a obzvlášť teploty u mníka. Motilita spermatu byla testována za teploty 4 a 30°C v následujících roztocích: seminální tekutina (SF), isotonické médium (plus Ca2+ nebo bez), hypotonické médium (plus Ca2+ nebo bez). Pokud jde o aktivaci motility spermatu v seminální tekutině při vysoké teplotě (30°C), zdá se, že během rutinní praxe v líhni nedochází k žádnému riziku při manipulaci se spermatem. Výsledky ukazují, že iniciace motility spermatu u mníka je zprostředkována souběžným působením Ca2+ a teploty. Proto lze dojít k závěru, že sperma mníka je mnohem citlivější na vysokou teplotu při iniciaci motility ve srovnání s jinými sladkovodními druhy ryb.
|
|
|
Změna abundance mRNA, oxidativních produktů a aktivit antioxidačních enzymů spojených se stárnutím rybích oocytů
MOHAGHEGHI SAMARIN, Azadeh
Opožděná přirozená reprodukce či umělý výtěr oocytů, a také jejich pozdější oplodnění při umělém výtěru vede k jejich stárnutí a následně přezrávání. I v dnešní době jsou ovšem znalosti o procesu stárnutí oocytů ryb nebo vyšších obratlovců velmi omezené. Některé studie prováděné na vyšších obratlovcích předpokládají, že na stárnutím oocytů má největší vliv zejména oxidativní stres. Tato práce se zabývá možnými změnami v mRNA transkriptu, který je způsobený oxidativním poškozením buněk, mitochondriální funkcí a stresovou reakcí a souvisí s následnou oplozeníschopností oocytů, vývojem embryí, transkripční regulací a cyklem buněk, a také apoptózou během přezrávání oocytů. Tato práce také sleduje oxidativní stavy oocytů během post-ovulačního stárnutí pomocí hodnot TBAR jakožto ukazatele oxidace lipidů a karbonylů ukazujících na prodloužení oxidace proteinů. Dále byla role oxidativního stresu v průběhu stárnutí oocytů hodnocena pomocí sledování aktivity antioxidačních enzymů jako jsou: CAT, SOD, GPX a GR. Dalšími hodnocenými parametry byly změny v jednotlivých skupinách lipidů, mastných kyselin, životaschopnosti oocytů a ploidní úroveni vylíhnutých larev. V případě sumečka afrického (Clarias gariepinus) dochází k přezrání oocytů 16 hodin po výtěru při jejich uchovávání v teplotě 25°C a za 24 hodin po výtěru u jiker skladovaných při 4°C. V případě obou sledovaných teplot bylo pozorováno postupné zvyšování mortality a počtu deformovaných larev v průběhu jejich uchovávání. Nejvyšší mortalita a nejnižší kvalita larev byly zaznamenány u nejdéle uchovávaných oocytů. Dále byl u vybraných druhů ryb stanoven čas, po který si jejich oocyty stále zachovávaly vysokou oplozeníschopnost. U lína obecného (Tinca tinca) je to 10 hodin při teplotě 20 °C, u karase zlatého (Carassius auratus) 18 hodin při 20 °C a v případě kapra obecného (Cyprinus carpio) je to 14 hodin po ovulaci a 10 hodin po umělém výtěru při 20 °C. Z výsledků práce je patrné, že v průběhu stárnutí oocytů nedošlo k žádné průkazné změně mRNA genů týkajících se oxidativního stresu a genů zapojených do buněčného cyklu během procesu stárnutí oocytů u sumečka afrického, karase zlatého a kapra obecného. Navíc u sledovaných druhů nedošlo v průběhu stárnutí oocytů ke změně hodnot TBAR a karbonylů. Avšak bylo pozorováno zvýšené množství mRNA apopticky příbuzných genů. Analýza antioxidačních enzymů nezaznamenala významné změny v hodnotách CAT a SOD během stárnutí oocytů po jejich získání u kapra obecného, karase zlatého a lína obecného. Nicméně významně snížená aktivita GPX byla pozorována při stárnutí oocytů u lína obecného, která by mohla odhalovat její významou roli v celkovém poklesu kvality jiker. Zmíněná snížená aktivita GPX nebyla pozorována u oocytů kapra obecného a karase zlatého. Kromě přímých účinků oxidativního stresu na oocyty by mohly jejich funkčnost ovlivnit i změny kompozice mastných kyselin a lipidů, které jsou způsobené oxidací. Pozorovali jsme, že při stárnutí oocytů se nemění složení mastných kyselin a skupin lipidů v oocytech. Proto podle našich získaných výsledků není oxidativní stres hlavním iniciátorem nebo promotorem procesu stárnutí oocytů. Avšak komplementární testy a analýzy jsou potřebné k jasnému vysvětlení jeho vlivu a zapojení do celého procesu stárnutí oocytů. Zvýšené hladiny mRNA apoptoticky souvisejících transkriptů během stárnutí oocytů v této práci demonstrují, že apoptotická dráha může být zapojena do molekulárních změn během stárnutí oocytů. Studium epigenetických změn spojených se stárnutím rybích oocytů se jeví jako velmi zajímavý výzkumný směr pro budoucí vědecké studie.
|
host ::
RSS.