|
|
Intermediate filament proteins of Preaxostyla flagellates
Švagr, Ezra ; Hampl, Vladimír (vedoucí práce) ; Varga, Vladimír (oponent)
6 Abstrakt Monocercomonoides exilis a Paratrimastix pyriformis jsou protista ze skupiny Preaxostyla (Excavata), mají exkavátní morfologii, která se považuje za ancestrální formu cytoskeletální organizace eukaryotických buněk. Podstatnou částí této morfologie jsou vlákna složená z dosud neidentifikovaných proteinů. Tato práce staví na teorii, že tyto vlákna jsou složena z proteinů Intermediárních filament (IF proteinů). IF proteiny jsou polyfyletická skupina proteinů, která se podílí na tvorbě mechano-elasticky významných vláken v eukaryotických buňkách. Nejvíce rozšířenou skupinou těchto proteinů jsou SF-assembliny, homology těchto proteinů byly poprvé popsány u druhu Chlamydomonas reinhardii, giardiny, proteinová rodina poprvé popsaná u Giardia intestinalis, jsou také příbuzné s těmito proteiny. Identifikace SF-assemblinů e u M. exilis a P. pyriformis by dále upevnila pozici SF-assemblinů jako obecně přítomného proteinu v eukaryotickém cytoskeletu. Cílem této práce bylo studovat proteiny přítomné v cytoskeletu exkavát dvěma způsoby. Zaprvé identifikovat proteiny v obohacené cytoskeletální frakci získané z kultur M. exilis a P. pyriformis. Zadruhé, lokalizovat SF-assembliny v obou protistech pomocí protilátek a expanzní mikroskopie. Protokol pro expanzní mikroskopii byl optimalizován pro oba organismy. V...
|
|
|
Proteom rostlin v reakci na abiotický stres
Čotková, Veronika
Rostliny si se svým přisedlým způsobem života vyvinuly komplexní mechanismy jak se vyrovnat s nepříznivými podmínkami prostředí. Tato diplomová práce shrnuje současné znalosti na toto téma a zaměřuje se na světlo, teplotu a fytohormony v odpovědích rostlin na abiotický stres. Praktická část se věnuje proteomice a dokončuje a navazuje na projekt zahájený během mé bakalářské práce. Transgenní klíční rostliny Arabidopsis nesoucí inducibilní cytokinin oxidázu/dehydrogenázu z ječmene (CaMV35S>GR>HvCKX2) byly profilovány pro objasnění odpovědí na úrovni proteomu na snížené hladiny cytokininů pod teplotním stresem za standardní (80 umol.m-2.s-1) a nízké intenzity světla (20 umol.m-2.s-1). Pomocí 2-DE analýzy a analýzy pomocí hmotnostní spektrometrie se podařilo celkem objevit 63 rozdílně abundantních proteinů zahrnutých v různých metabolických procesech. Tato data poskytují důkaz o spojení mezi teplotní, světelnou a cytokininovou signalizací v Arabidopsis a budou použita při modelování interakcí cytokininy - světlo - teplota.
|
|
|
Isolation and characterisation of extracellular vesicles of parasitic helminths
MAZANEC, Hynek
Exkrečně sekreční produkty (ESP) slouží jako důležití mediátoři mezibuněčných a mezidruhových komunikací. Původně se předpokládalo, že jsou vylučovány hlavně v rozpustné formě, ale nedávné objevy naznačují i jejich vylučování za pomoci extracelulárních vezikul (EV). Tyto membránové částice poskytují svému obsahu ochranu před degradací a zároveň i cílený transport skrz specifických receptorů na svém povrchu. Díky tomu jsou studovány jako silné imunomodulátory vztahů mezi hostitelem a patogenem. S ohledem na parazitické helminty, EV jsou studovány jako prostředky pro diagnostiku, vakcinaci či terapii. Nicméně jejich obecná biologie, zejména pak jejich biogeneze, je stále špatně prostudována v porovnání s jejich potenciální funkců. Cílem této práce je tedy podrobněji prozkoumat sekreční aktivitu EV u různých zástupců tasemnic a jejich životních stádií. Životní cyklus tasemnice Schistocephalus solidus byl založen v laboratorních podmínkách za účelem studia sekrece EV napříč jednotlivými stádii. Zároveň jsme prozkoumali hlavní cesty biogeneze EV u tasemnice Hymenolepis diminuta za pomoci ultrastrukturních a proteomických analýz. Oba směry zároveň umožnily porovnání tvorby EV u tasemnic s různými typy hostitelů.
|
|
|
Integrated multi-omics analysis of chemical signaling in wild rodents
Matějková, Tereza ; Stopka, Pavel (vedoucí práce) ; Macholán, Miloš (oponent) ; Bryja, Josef (oponent)
Bakterie žijící v symbióze se svým hostitelem v takzvaných mikrobiomech jsou jedním z hlavních pilířů evoluce živočichů, včetně evoluce jejich chemické komunikace. Fenotyp, genotyp a mikrobiom laboratorních živočichů chovaných po generace ve sterilních podmínkách se však od jejich divokých předků změnil, což vede k výrazným rozdílům mezi výsledky získanými z laboratorních organismů a z jejich divokých protějšků. Tato práce se zaměřuje na chemickou komunikaci u volně žijících hlodavců. Konkrétně zkoumá části těla, které se přímo podílí na chemické komunikaci (tj. ústa, pochva a střeva) a které jsou zároveň obývány mikrobiomy produkující chemické signály. Změny mikrobiomu, proteomu a metabolomu divokých myší jsou v této práci studovány pomocí sekvenování nové generace a nejmodernější proteomové a metabolomové chromatografie - hmotnostní spektrometrie. Práce analyzuje změny mikrobiomu v rámci přesunu divokých jedinců do zajetí, společného soužití divokých a laboratorních zvířat a také v kontextu hormonálních změn během estrálních cyklů. Dále tato práce diskutuje rozdíly a podobnosti v mikrobiomu, proteomu a metabolomu na úrovni různých druhů (Apodemus sp.), poddruhů (Mus musculus domesticus vs. musculus) a prostředí (přirozený vs. laboratorní původu). Výsledky ukazují, že mikrobiom zůstává během...
|
|
|
Metodika pro identifikaci cizích amyláz v medu
Erban, Tomáš ; Shcherbachenko, Elena ; Talacko, Pavel ; Harant, Karel
Včelí med je unikátní přírodní produkt. Med je odedávna využíván jako lahodná sladká potravina. Je však ceněn také pro mnohostranné léčivé účinky. Med bohužel patří mezi nejfalšovanější potraviny. Do medu nesmí být nic přidáváno a nesmí být upravován. S medem je také potřeba zacházet opatrně, protože jeho kvalitu může negativně ovlivnit způsob zpracování. Med může výrazně ovlivnit nešetrné rozehřívání. I přes velký pokrok v analytických metodách se nedaří prokázat všechny falšované medy. Některé způsoby falšování jsou totiž dosti sofistikované. Proto je potřeba hledat nové přístupy a metody pro odhalování falšování medu. Aby mohl být med prodáván, musí splňovat mezinárodně platné normy, které platí také na národních úrovních s případnými modifikacemi. Jedním z důležitých parametrů pro med je míra diastázové neboli amylázové enzymové aktivity, která je uznávaným indikátorem čerstvosti a kvality medu. Snížená diastázová aktivita pod stanovenou normu může indikovat starý med, ale může být také důsledkem nešetrného zacházení s medem. V neposlední řadě může být diastázová aktivita snížena v důsledku falšování medu, jako je jeho ředění cukernými náhražkami. Někdy může být amylázová aktivita uměle nastavena přidáním enzymů. Takto falšovaný med sice splní stanovené legislativní požadavky pro uvedení na trh, ale nastavením amylázové aktivity je porušen zákaz o přidávání látek do medu. Dosud používané metody neumožňovaly odhalení takovéhoto způsobu falšování. Proto se tato metodika zaměřuje právě na specifickou identifikaci cizích amyláz, které se mohou v medu vyskytovat. Metodika umožňuje identifikovat bottom-up shotgun proteomickým přístupem prakticky jakoukoliv cizí amylázu v medu. Identifikované specifické peptidy získané na základě tohoto metodického postupu mohou být později využity pro vývoj cílené metody pro identifikaci cizích amyláz.
Plný text:  PDF
|
|
|
Příprava a využití proteas vhodných ke studiu struktury proteinů.
Jirečková, Barbora ; Man, Petr (vedoucí práce) ; Vaňková, Pavla (oponent)
Vodík/deuteriová výměna spojená s hmotnostní spektrometrií (HDX-MS) je metoda, která umožňuje studium struktury a dynamiky proteinů. Pro lokalizaci této výměny je do HDX-MS zařazena proteolýza analyzovaného proteinu, která určuje prostorové rozlišení. Standardně se používá pepsin, který má ale své limitace, a také štěpení pouze jednou proteasou často neposkytuje optimální prostorové rozlišení. V několika publikacích byl akcentován význam alternativních proteas nepenthesinu-2 (Nep-2) a aspergillopepsinu (XIII), které oproti pepsinu štěpí za bazickými aminokyselinami. Při studiu na prolin bohatých proteinů získává význam prolyl endoproteasa z Aspergillus niger (AnPEP). Tato práce se zabývá charakterizací imobilizovaného AnPEPu v kombinaci s proteasami pepsinem, aspergillopepsinem nebo Nep-2 za účelem jejich aplikace v HDX-MS. Nejprve byly na sadě modelových proteinů otestovány kolony s pouze jednou proteasou. Bylo zjištěno, že imobilizovaný AnPEP oproti ostatním proteasám nemá optimální štěpné charakteristiky. Za účelem spojení výhod výše uvedených proteas byly modelové proteiny štěpeny pomocí kolon s AnPEP koimobilizovaným s pepsinem, Nep-2 nebo XIII a také pomocí dvou proteasových kolon v sériovém zapojení (vždy AnPEP kolona s pepsinovou, Nep-2 nebo XIII kolonou v obou směrech). V rámci štěpení...
|
|
|
Výzkum epigenetických aspektů kmenových buněk krvetvorby a spermatogeneze.
Hybešová, Michaela ; Pimková, Kristýna (vedoucí práce) ; Děd, Lukáš (oponent)
Diferenciace kmenových buněk je řízená koordinovanou regulací genové transkripce. Jedním z regulačních faktorů je rozvolnění chromatinu a zpřístupnění DNA k transkripčním faktorům. Remodelace chromatinu je zajišťována remodelačními komplexy. ISWI chromatin remodelující ATPáza Smarca5 (S5) je významným faktorem remodelačních komplexů. Jedná se o vysoce konzervovaný chromatin-remodelační faktor, který se nachází v několika komplexech oligopodjednotek a tvoří zde katalytickou podjednotku. V těchto komplexech aktivně reguluje strukturu a přestavbu nukleozomu během replikace, oprav a transkripce DNA. Bylo zjištěno, že S5 je klíčový protein pro embryonální vývoj. Jeho nedostatek vede k poruchám krvetvorby a vývoji samčích pohlavních orgánů. V této práci jsme se zaměřili na roli S5 v hematopoéze a spermatogenezi. Pomocí myšího modelu s transgenní expresí S5, ko-imunoprecipitace a hmotnostní spektrometrie jsme identifikovali komplexy, v nichž se S5 nachází v hematopoetických orgánech a v buňkách v testes. Studovali jsme také fenotypové následky deficitu S5 v myších testes a zjistili, že vede k poruše vývoje spermií a samčí sterilitě. Pomocí transkriptomické a proteomické analýzy jsme identifikovali, některé molekulární programy, které by mohly k poruchám reprodukce vést. Naše práce naznačuje, že S5 je...
|
|
|
Identification and characterization of ciliary tip proteins
Gorilák, Peter ; Varga, Vladimír (vedoucí práce) ; Lánský, Zdeněk (oponent) ; Dean, Samuel (oponent)
Distální konec řasinky/bičíku, také známý jako doména ciliární špičky (CTD), je nepostradatelná pro strukturu a funkci eukaryotických řasinek. Lepšímu porozumění této domény brání nedostatečné znalosti jejích proteinových komponentů. Cílem dizertační práce bylo ověřit lokalizaci vybraných známých proteinů CTD savčích řasinek, a testovat lokalizaci kandidátních CTD proteinů, jejichž ortology se nacházejí na špičce bičíku evolučne vzdáleného prvoka Trypanosoma brucei. Pomocí našeho lokalizačního postupu jsme identifikovali dva proteiny, které výrazně lokalizují do CTD primární řasinky. Jeden z těchto proteinů, ZC2HC1C, navíc také lokalizuje do stacionárních bodů podél axonemy, jejichž pozice se shodují s místy zastavení a otáčení intraflagelárních vlaků. Předpokládáme, že se může jednat o konce sub-distálně končících axonemalních mikrotubulů. Dále prokazujeme, že protein ULK4 lokalizuje do CTD pohyblivých ependymálních řasinek, ale ne do CTD primárnich řasinek, což je v souladu s dříve publikovanými fenotypy u ULK4 knock- outových myší a dokládá rozdíly ve složení CTD těchto dvou typů řasinek. Nakonec jsme ukázali, že Expanzní mikroskopie je rychlá a robustní super-rezoluční metoda, vhodná pro ultrastrukturální a lokalizační studie CTD savčích řasinek a bičíků T. brucei.
|
|
|
Vývoj workflow pro kontrolu kvality hmotnostně-spektrometrických dat v prostředí KNIME
Schneiderová, Anna ; Zezula, Nikodém (oponent) ; Potěšil,, David (vedoucí práce)
Proteomický experiment s využitím kapalinové chromatografie a hmotnostní spektrometrie je velmi komplexní technika s celou řadou proměnných, které mohou ovlivnit kvalitu výstupních dat. Průběžná kontrola kvality výstupních dat a stavu používané instrumentace je proto klíčová pro získání kvalitních dat. Pro systematickou a automatizovanou kontrolu kvality dat bylo navrženo workflow, které bylo následně implementováno v prostředí KNIME. Workflow umožňuje získat a zaznamenat vybrané metriky pro kontrolu kvality, které je možné využít ke sledování variability v datech a zachytit počínající technické problémy systému.
|
|
|
Proteomic analysis of posttranslation modifications in breast cancer cell line profiles
Predná, Nikola ; Laštovičková,, Markéta (oponent) ; Strouhalová,, Dana (vedoucí práce)
Estrogen and progesterone receptors, as well as HER2 protein, are currently the most clinically useful metabolic markers in breast cancer. These markers allow for the determination of the type of tumor and its best treatment options. However, one of the most aggressive types of this disease, triple-negative breast cancer (TNBC), lacks these clinically established biomarkers. This means that hormone therapy or targeted drugs are not an option, leaving fewer treatment options to choose from. In order for new tailored drugs to be developed, the understanding of the molecular basis of the disease is crucial. Recently, many studies aim their search for biomarkers at the protein level using proteomics. Proteins, notably their post-translational modifications (PTM), are at the core of many cellular events and their uncovering may help in the understanding of breast cancer mechanisms.In order to discover the molecular features of TNBC, this study aims to compare proteomic data of untreated cancer cell lines with cells that underwent retinoid therapy. The focus will be on the PTMs, notably glycosylation and phosphorylation, of Vimentin and CD44, which were proposed as potential TNBC biomarkers in previous studies. Protein separation will be carried out using 1D and 2D gel electrophoresis or by SEC-HPLC. The samples will also be subdued to enzymatic cleavage before being identified using MALDI-TOF Mass Spectrometry. In the case of phosphoprotein selective capture, enrichment will be performed by affinity chromatography using TiO2 phosphopeptide enrichment tips (TopTip). Glycosylated proteins will be enriched using WGA lectin affinity based chromatography. Proteins with significant differences in PTMs between the treated and untreated cells will be evaluated using protein databases (MASCOT, STRING, and more). The data acquired from the study will eventually be used to propose potential biomarkers for TNBC.
|
host ::
RSS.