|
|
Role of PML in ribosomal stress
Kremserová, Petra ; Vašicová, Pavla (vedoucí práce) ; Sztacho, Martin (oponent)
PML je zapojen do řady buněčných procesů. Je organizátorem subjaderných struktur zvaných jaderná tělíska PML a asociuje s jadérkem při odpovědi na ribozomální stres tvorbou jadérkových struktur PML (PNAs). Funkce těchto struktur je nejasná a jednou z možností jejího objasnění je identifikace proteinů interagujících s PML v jadérku. Běžně používanou metodou je koimunoprecipitace, bohužel tento přístup nelze u PML použít pro jeho nízkou rozpustnost. Jednou z alternativ pro překonání této překážky je metoda značení interakčních partnerů biotinem. Cílem této práce bylo ověření využitelnosti metody značení biotinem pro identifikaci interakčních partnerů PML v jadérku. Za tímto účelem jsem vytvořila konstrukty kódující PML IV či její mutovanou formu fúzované s GFP a biotin ligázou pro tranzientní a stabilní expresi, a analyzovala jsem jejich schopnost tvořit PML NBs, doxorubicinem indukované PNAs a schopnost biotinylace. Oba tranzientně exprimované fúzní proteiny tvořily PML NBs a jen divoká forma PML IV tvořila PNAs po ovlivnění doxorubicinem. Schopnost biotinylovat byla zachována. V buňkách s deletovaným genem pro PML stabilně exprimujících fúzní proteiny bylo detekováno aberantní množství a kompozice PML NBs a nebyly pozorovány PNAs. Nicméně tento systém byl využit pro optimalizaci solubilizace biotinylovaných...
|
|
|
Strukturní charakterizace lidské proteinkinasy CaMKK2 a jejích interakcí s vazebnými partnery
Koupilová, Nicola ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
4 Abstrakt Ca2+/kalmodulin-dependentní proteinkinasa kinasa 2 (CaMKK2) patří do rodiny serin/threonin proteinkinas, které se účastní vápníkové signální dráhy. Při zvýšení intracelulární koncentrace vápenatých kationtů dochází k aktivaci kalmodulinu (CaM), který následně aktivuje své vazebné partnery, mezi které patří CaMKII, CaMKIII, CaMKK1 a CaMKK2. CaMKK2 následně aktivuje prostřednictvím fosforylace proteinkinasy CaMKI, CaMKIV a AMP-dependentní kinasu, AMPK. Přirozeně se v buňkách CaMKK2 vyskytuje v autoinhibovaném stavu, který je způsobený sterickým bráněním aktivního místa autoinhibiční doménou. Při vazbě s kalmodulinem dochází k odklonění autoinhibiční domény a tím ke zpřístupnění aktivního místa. Po aktivaci dochází u CaMKK k autofosforylaci a tím ke zvýšení aktivity. Negativní regulace je způsobena fosforylací cAMP-dependentní proteinkinasou A (PKA) a GSK3. Pro CaMKK1 i CaMKK2 byla identifikována místa, která jsou fosforylována PKA. Dvě z nich jsou součástí vazebného motivu pro proteiny 14-3-3. Předchozí studie ukázaly, že protein 14-3-3 udržuje fosforylovanou CaMKK2 v inhibovaném stavu tím, že brání defosforylaci S495, který blokuje vytvoření vazby s kalmodulinem. Nicméně je nejasné, jestli je to jediná úloha proteinu 14-3-3 v regulaci CaMKK2. Hlavním cílem této diplomové práce byla optimalizace...
|
|
|
Identification of small compounds disrupting protein-protein interaction in influenza A polymerase.
Hejdánek, Jakub ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent)
Virus chřipky napadá ptactvo a savce a způsobuje u nich závažnou infekci, která je ročně příčinou téměř půl milionu lidských obětí. Dodnes jsou terapeutickými cíly pouze dvě molekuly v životním cyklu viru - M2 protonový kanál a neuraminidasa. Vznik nových pandemických subtypů je současně s vývojem resistentních variant proti současným lékům závažným podnětem pro nalezení nových cílů a potenciálně jejich inhibitorů. V nedávné době byla pomocí strukturní krystalografie identifikována protein-proteinová interakce mezi PA a PB1 podjednotkou virové polymerasy jakožto zajímavý therapeutický cíl. Zajímavé je, že tato interakce je zprostředkována jen několika interagujícími aminokyselinovými zbytky. Další zajímavý fakt je, že tyto zbytky vykazují vysokou konzervovanost mezi variantami viru chřipky typu A, což by v případě nalezení inhibitoru mohlo umožnit zacílit širokospektrální léčbu proti všem kmenům tohoto typu viru. V této práci jsem se zabýval expresí a purifikací dvou fúzních rekombinantních proteinových konstruktů C-terminální domény PA podjednotky (CPA) z pandemického subtypu viru chřipky A/California/07/2009 (H1N1). První konstrukt byl navrhnut k evaulaci kinetických vlastností interakce mezi PB1 peptidem a CPA proteinem. Dále byl tento konstrukt použit k vývoji vysoko-kapacitní testovací analýzy...
|
|
|
Studium interakcí forkhead box O (FOXO) transkripčních faktorů s DNA
Hofmanová, Adéla ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Tato práce se zabývá studiem "O" podskupiny FOX transkripčních faktorů, která sestává ze čtyř zástupců (FOXO1, FOXO3, FOXO4 a FOXO6). Jedná se o významné regulační molekuly, které hrají zásadní roli v kontrole buněčného cyklu, odpovědi organismu na stres, diferenciaci a apoptóze. Na základě jejich schopnosti vyvolat buněčnou smrt jsou obecně považovány za tumorové supresory. Nedávné studie však ukázaly, že jejich působení může mít i opačný účinek, tedy že mají schopnost podpořit vývoj nádoru, či vyvolat rezistenci na léčiva používaná při léčbě některých typů národů. Přes intenzivní výzkum zůstává řada otázek týkajících se funkce FOXO proteinů stále nezodpovězená. Jednou z nich je, zda drobné strukturní rozdíly pozorované v jinak vysoce konzervovaných DNA-vazebných doménách (DBD) jednotlivých zástupců FOXO transkripčních faktorů mají vliv na DNA-vazebnou afinitu. Dále pak, zda má nedávno popsaná protein-proteinová interakce FOXO-DBD s transkripčním faktorem p53 vliv na jejich DNA-vazebné vlastnosti, nebo jaký je význam vazebného místa pro Mg2+ ion nalezeného v krystalové struktuře komplexu FOXO4-DBD:DNA. Pro objasnění těchto otázek byly exprimovány a purifikovány DNA-vazebné domény lidských transkripčních faktorů FOXO3 a FOXO4 (FOXO3-DBD142-267 a FOXO4-DBD82-207). Pomocí změn stacionární anisotropie...
|
|
|
Role of PML in ribosomal stress
Kremserová, Petra ; Vašicová, Pavla (vedoucí práce) ; Sztacho, Martin (oponent)
PML je zapojen do řady buněčných procesů. Je organizátorem subjaderných struktur zvaných jaderná tělíska PML a asociuje s jadérkem při odpovědi na ribozomální stres tvorbou jadérkových struktur PML (PNAs). Funkce těchto struktur je nejasná a jednou z možností jejího objasnění je identifikace proteinů interagujících s PML v jadérku. Běžně používanou metodou je koimunoprecipitace, bohužel tento přístup nelze u PML použít pro jeho nízkou rozpustnost. Jednou z alternativ pro překonání této překážky je metoda značení interakčních partnerů biotinem. Cílem této práce bylo ověření využitelnosti metody značení biotinem pro identifikaci interakčních partnerů PML v jadérku. Za tímto účelem jsem vytvořila konstrukty kódující PML IV či její mutovanou formu fúzované s GFP a biotin ligázou pro tranzientní a stabilní expresi, a analyzovala jsem jejich schopnost tvořit PML NBs, doxorubicinem indukované PNAs a schopnost biotinylace. Oba tranzientně exprimované fúzní proteiny tvořily PML NBs a jen divoká forma PML IV tvořila PNAs po ovlivnění doxorubicinem. Schopnost biotinylovat byla zachována. V buňkách s deletovaným genem pro PML stabilně exprimujících fúzní proteiny bylo detekováno aberantní množství a kompozice PML NBs a nebyly pozorovány PNAs. Nicméně tento systém byl využit pro optimalizaci solubilizace biotinylovaných...
|
|
|
Vliv cytochromu b5 na enzymovou kinetiku hydroxylace Sudanu I lidským cytochromem P450 1A1
Netolický, Jakub ; Martínek, Václav (vedoucí práce) ; Černá, Věra (oponent)
Cytochromy P450 jsou jedny z hlavních enzymů přeměňujících xenobiotika. Jsou řazeny mezi monooxygenasy se smíšenou funkcí (MFO). Isoforma 1A1 je extrahepatální forma nacházející se hlavně v plicích, minoritně i v jiných orgánech. Je výrazně indukována polycyklickými aromatickými uhlovodíky a jejich deriváty prostřednictvím Ah receptoru. Jako markerové reakce pro tento enzym lze využít hydroxylace Sudanu I, který se dříve hojně používal jako barvivo v průmyslu. V 80. letech byl prokázán jeho negativní vliv na organismus. NADPH:cytochrom P450 reduktasa je hlavním donorem elektronů pro monooxygenační reakce katalyzované cytochromy P450. Dalším přenašečem elektronů pro reakce katalyzované cytochromy P450 je pak cytochrom b5. Jak již bylo dokázáno, vzájemný poměr reduktasy a cytochromu b5 může mít vliv na přeměnu řady xenobiotik tedy i na hydroxylaci Sudanu I. Tato práce se zabývá vlivem vzájemných poměrů NADPH:cytochrom P450 reduktasy a cytochromu b5 vůči cytochromu P450 1A1 na hydroxylaci Sudanu I. Hlavním úkolem tedy je charakterizovat vliv poměrů elektronového donoru a elektronového přenašeče na hydroxylaci Sudanu I, konkrétně určit kinetické parametry KM a VMAX pro vybrané poměry proteinů. Dílčími úkoly práce pak bylo charakterizovat využívané proteiny a případně je purifikovat, optimalizovat...
|
|
|
Structural studies of selected signaling protein complexes.
Pšenáková, Katarína ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Hrabal, Richard (oponent) ; Maloy Řezáčová, Pavlína (oponent)
Schopnost proteinů vázat jiné molekuly v reakci na různé podněty ve svém mikrookolí je základem rozsáhlých regulačních sítí, které koordinují následnou činnost buněk. Správná funkce těchto signálních drah závisí převážně na nekovalentních interakcích, které často ovlivňují strukturu proteinů a proteinových komplexů. Pochopení molekulárního mechanismu funkce proteinu v buněčné signalizaci je proto často závislé na znalosti jeho trojdimenzionální struktury. V této disertační práci představuji studie, které vedly na molekulární úrovni k pochopení několika protein-proteinových a ligand-proteinových interakcí podílejících se na buněčné signalizaci. Použila jsem nukleární magnetickou rezonanci (NMR), malo- úhlový rozptyl rentgenového záření (SAXS) a další biofyzikální metody pro určení molekulární podstaty inhibice čtyř signálních proteinů: vápník/kalmodulin (Ca2+ /CaM)- dependentní proteinkinasy kinasy 2 (CaMKK2); proteasy kaspasa-2; forkhead transkripčního faktoru FOXO3 a proteinkinasy ASK1. Konkrétněji byla zkoumána role proteinu 14-3-3 a CaM v regulaci CaMKK2 aktivity. Dále byl detailně studován mechanizmus, jakým protein 14-3-3 ovlivňuje schopnost oligomerizace a jaderné lokalizace kaspasy-2 a také byla objasněna podstata modulace transkripční aktivity FOXO transkripčních faktorů díky zkoumání...
|
|
|
Identification of small compounds disrupting protein-protein interaction in influenza A polymerase.
Hejdánek, Jakub ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent)
Virus chřipky napadá ptactvo a savce a způsobuje u nich závažnou infekci, která je ročně příčinou téměř půl milionu lidských obětí. Dodnes jsou terapeutickými cíly pouze dvě molekuly v životním cyklu viru - M2 protonový kanál a neuraminidasa. Vznik nových pandemických subtypů je současně s vývojem resistentních variant proti současným lékům závažným podnětem pro nalezení nových cílů a potenciálně jejich inhibitorů. V nedávné době byla pomocí strukturní krystalografie identifikována protein-proteinová interakce mezi PA a PB1 podjednotkou virové polymerasy jakožto zajímavý therapeutický cíl. Zajímavé je, že tato interakce je zprostředkována jen několika interagujícími aminokyselinovými zbytky. Další zajímavý fakt je, že tyto zbytky vykazují vysokou konzervovanost mezi variantami viru chřipky typu A, což by v případě nalezení inhibitoru mohlo umožnit zacílit širokospektrální léčbu proti všem kmenům tohoto typu viru. V této práci jsem se zabýval expresí a purifikací dvou fúzních rekombinantních proteinových konstruktů C-terminální domény PA podjednotky (CPA) z pandemického subtypu viru chřipky A/California/07/2009 (H1N1). První konstrukt byl navrhnut k evaulaci kinetických vlastností interakce mezi PB1 peptidem a CPA proteinem. Dále byl tento konstrukt použit k vývoji vysoko-kapacitní testovací analýzy...
|
|
|
Studium protein-proteinových interakcí v bakteriální pathogenesi: využití metodiky PIXL (photo-induced cross-linking)
Žídek, Radek ; Šulc, Miroslav (vedoucí práce) ; Ječmen, Tomáš (oponent)
Gramnegativní bakterie druhu Bordetella pertussis jsou původci smrtelného lidského onemocnění označovaného jako pertuse, častěji jako černý kašel. Tyto bakterie produkují adenylátcyklázový toxin (ACT), který se váže na povrch makrofágů a umožňuje vpravit do cytosolu hostitelské buňky přes cytoplazmatickou membránu adenylátcyklázovou doménu (dAC). Abychom mohli studovat kovalentní interakce mezi proteiny pomocí fotochemického zesítění, byl náš studovaný protein exprimován s foto-methioninem (kyselinou L-2-amino-5,5- azi-hexanovou) v kultivačním médiu v bakteriálním kmenu Escherichia coli B834 (DE3). Foto- methionin je netoxickým analogem L-methioninu, takže je normálně inkorporován pomocí aminoacyl-tRNA syntház do struktury adenylátcyklázové domény. Maximální míry inkorporace foto-methioninu do struktury dAC bylo dosaženo po optimalizaci celého expresního protokolu. Celková míra inkorporace foto-methioninu do struktury proteinu po optimalizaci zjištěná hmotnostně-spektrometrickou analýzou byla až 80 %. Získaný protein s inkorporovaným foto- methioninem byl izolován. Byly provedeny síťovací experimenty s kalmodulinem a vláknitým hemaglutininem. Při těchto experimentech bylo provedeno jak fotochemické, tak i chemické zesítění. Vzniklé kovalentně zesítěné produkty byly rozděleny pomocí SDS-PAGE a...
|
|
|
Exprese a purifikace fotoaktivované proteinové nanosondy pro studium klinicky relevantních protein-proteinových interakcí
Knížek, Antonín ; Šulc, Miroslav (vedoucí práce) ; Koblihová, Jitka (oponent)
Cytochrom b5 je klíčovým proteinem pro funkci a regulaci savčí oxygenasy se smíšenou funkcí (MFO), která se nachází v endoplasmatickém retikulu. Proto je také relevantním cílem v klinicky zaměřených studiích. Abychom mohli studovat interakce cytochromu b5 pomocí kovalentního fotochemického zesítění, vytvořili jsme mutanty cytochromu b5 s methioninem v několika klíčových aminokyselinových pozicích v primární sekvenci proteinu, např. v pozici serinu 23 a leucinu 41. Přirozeně se vyskytující methioniny v cytochromu b5 (pozice 96, 126 a 131) byly zároveň mutovány na leucin bez vlivu na aktivitu cytochromu b5. Náš protein byl exprimován v auxotrofních bakteriích E. coli B834(DE3) s L-2-amino-5,5-azi- hexanovou kyselinou (foto-methioninem) přítomnou v kultivačním médiu. Tento methioninový analog s fotolabilním diazirinovým kruhem je aminoacyl-tRNA synthetasami běžně inkorporován do primární sekvence proteinu. Celý expresní protokol byl optimalizován tak, abychom dosáhli maximální míry inkorporace foto-methioninu do struktury cytochromu b5. Získaný exprimovaný protein byl izolován a míra inkorporace byla stanovena hmotnostně spektrometrickou analýzou pomocí MALDI-TOF. Dosáhli jsme až 93,4% inkorporace. Po rekonstituci se svými přirozenými interakčními partnery - cytochromem P450 2B4 (králičí isoforma) a...
|
host ::
RSS.