|
|
Role histon deacetylázy 6 v replikačním cyklu myšího polyomaviru
Vlachová, Štěpánka ; Horníková, Lenka (vedoucí práce) ; Saláková, Martina (oponent)
Replikační cyklus polyomavirů je stejně jako u ostatních virů zcela závislý na hostitelských buňkách. Pro viry je důležitý nejen buněčný replikační a translační aparát, ale virovou infekci ovlivňují také další buněčné proteiny. Tato práce se zabývá rolí hlavní cytoplazmatické deacetylázy histon deacetylázy 6 (HDAC6) v replikačním cyklu myšího polyomaviru (MPyV). Podařilo se nám prokázat, že přítomnost plně funkční HDAC6 je nezbytná pro úspěšnou a produktivní infekci. Zjistili jsme, že HDAC6 ovlivňuje jak časné, tak i pozdní fáze infekce. Při inhibici, či úplně absenci tohoto proteinu v buňkách je MPyV infikuje s menší efektivitou a zároveň při infekci vzniká méně infekčního virového potomstva. Naopak při využití buněk s částečně funkční HDAC6 schopnou buď deacetylace či vazby ubiquitinu se schopnost MPyV infikovat tyto buňky zvyšuje. Analýzou hladin časného LT antigenu a pozdního strukturního proteinu VP1 jsme prokázali, že HDAC6 ovlivňuje jejich hladiny v infikovaných buňkách. Naše data také naznačují, že v replikačním cyklu MPyV je vyžadována přítomnost především ubiquitin-vazebné domény HDAC6 a s ní spojená funkce v metabolismu a degradaci virových a buněčných proteinů. V druhé části diplomového projektu jsme se zaměřili na přípravu expresních plazmidů nesoucích časnou genovou oblast kódující...
|
|
|
Targeting of viral nanoparticles to cancer specific receptors
Žáčková Suchanová, Jiřina
Úkolem této práce bylo prozkoumat potenciál umělých virových částic (virus-like particles, VLPs) odvozených od myšího polyomaviru (MPyV) jako možných nanonosičů pro řízenou dopravu terapeutických a diagnostických látek do specifických buněk či tkání. Vybrali jsme VLPs myšího polyomaviru, protože neobsahují virovou DNA a jsou považovány za bezpečné pro využití v bioaplikacích. Při našem výzkumu jsme použili přístup chemické modifikace pro přesměrování VLPs z jejich přirozeného receptoru na nádorové buňky. Lysinové zbytky exponované na povrchu částice byly modifikovány aldehydickým činidlem pro následnou konjugaci vybraných molekul, transferinu a inhibitoru glutamát karboxypeptidázy II (GCPII), na povrch částice. Transferin, transportér iontů železa do metabolicky aktivních buněk, pomohl k přesměrování VLPs do různých druhů nádorových buněk nadměrně produkujících transferinový receptor. Na druhou stranu, GCPII slouží jako transmembránový antigen specificky se vyskytující na buňkách nádoru prostaty a připojení malé molekuly inhibitoru k VLPs vedlo k úspěšnému rozpoznání těchto buněk. Použili jsme metodu elektronové mikroskopie k vizualizaci obou typů modifikovaných VLPs a metody průtokové cytometrie a konfokální mikroskopie pro studium specifických buněčných interakcí a internalizace nanočástic. Dále...
|
|
|
Experimentální systém pro produkci IL-15 na virových nosičích
Musil, Dominik ; Španielová, Hana (vedoucí práce) ; Šmahel, Michal (oponent)
Interleukin 15 má velký potenciál pro využití například v biologické léčbě nádorových onemocnění. Je zapojen do celé řady imunitních procesů, kde mezi nejdůležitější z nich patří ovlivnění a indukce proliferace NK buněk a T-lymfocytů. Při terapeutickém použití je jeho nevýhodou nízká stabilita a krátký poločas života v organismu. Z tohoto důvodu jsou zkoumány různé možnosti, jak ho stabilizovat a rozšířit jeho biologickou aktivitu. V rámci této práce byl analyzován nový přístup, kdy byly využity virové nanostruktury odvozené od hlavního kapsidového proteinu myšího polyomaviru VP1 jako nosiče IL-15. VP1 proteiny tvořící nanonosiče mohou být relativně snadno modifikovány a jsou schopné umožnit průnik do nádorové tkáně. V bakulovirovém expresním systému v buňkách SF9 byly spolu s kontrolními nanostrukturami produkovány dvě varianty lidského IL-15, z nichž jedna byla tvořena samotným IL-15 a druhá fúzním proteinem IL-15 a zkrácenou variantou VP1. Proteinové konstrukty byly charakterizovány elektronovou mikroskopií a biochemickými metodami. Celkový proteinový výtěžek fúzní varianty VP1ΔC-IL15-HIS byl vyšší (dosahoval až 53 mg/L kompletního média) než samotného IL-15 (8,5 mg/L). Při testování biologické aktivity připravených proteinových konstruktů nicméně nebyla u žádného z nich prokázána indukce...
|
|
|
Vývoj techniky pro transfer genů do T-lymfocytů pomocí polyomavirových struktur a peptidu LAH4
Schreiberová, Lucie ; Španielová, Hana (vedoucí práce) ; Vopálenský, Václav (oponent)
Efektivní doprava genetického materiálu do T-lymfocytů je klíčová při genové terapii využívající T-lymfocyty s chimérickými antigenními receptory. Dosavadní postupy vyžadují použití potenciálně nebezpečných virových vektorů nebo velké množství vstupního materiálu. Diplomová práce se proto soustředí na prozkoumání nových přístupů pro transfer genů do T-lymfocytů: využití bezpečných viru podobných částic (VLP) odvozených od myšího polyomaviru v kombinaci s amfipatickým kationickým peptidem LAH4. LAH4 má potenciál zvyšovat efektivitu dopravy DNA i virových vektorů do buněk. Systém kombinující VLP a peptid LAH4 byl optimalizován pro dopravu reportérových genů (kódujících GFP a luciferázu) do modelové T-lymfocytární linie Jurkat. Bylo zjištěno, že pomocí VLP se zabalenou DNA nelze efektivně transdukovat buňky Jurkat. Při transfekci buněk samotnou DNA s LAH4 nebylo dosaženo konzistentních výsledků a efektivita transfekce se pohybovala od 0,5 do 19 %. V rámci diplomové práce byl také analyzován vliv fosforylace virových struktur na transfer genů. Byl studován dopad opůsobení virových částic alkalickou fosfatázou na infektivitu viru a bylo nutné analyzovat vliv reakčních složek. Sublytická koncentrace Tritonu-X100 v reakčním pufru pozitivně ovlivňovala infektivitu MPyV více než vlastní defosforylace. V...
|
|
|
Role acetylace proteinů v životním cyklu Polyomavirů
Dostalík, Pavel ; Horníková, Lenka (vedoucí práce) ; Saláková, Martina (oponent)
Virová částice myšího polyomaviru je složená ze 3 strukturních proteinů: majoritní strukturní VP1 a minoritní strukturní ů ci řady proteinů mohou ovlivňovat jejich posttranslační modifikace. Tato práce se zaměřuje na to jaký dopad mají acetylace strukturních proteinů na replikační cyklus MPyV. První část této práce se zabývá acetylací proteinu VP1. Podařilo se nám prokázat, ž tento protein acetylovaný ve virové čá é to, že proces acetylace je závislý na přítomnosti minoritních proteinů aké se nám podařilo prokázat, že pro infektivitu viru je důležitá HDAC6 ejí nadprodukce snižuje infektivitu viru, stejný efek é u viru izolovaného z HDAC6 KO buněk. Naše data naznačují že VP1 protein je substrátem HDAC6. Podařilo se nám zjistit, že VP1 protein viru izolovaného z HDAC6 KO buněk íce acetylovaný ve srovnání s původním vire Ve druhé čá ěřili na N' terminální acetylace proteinu na jeho N' konci byla už dříve popsána a jeho mutace zabraňující této acetylaci vede tomu, že e takový MPyV neinfekční. Proto jsme chtěli zjistit, zda je N' terminální důležitá pro stabilitu VP3 proteinu. Naše předběžné výsledky naznačují, že N' terminálně acetylovaný VP3 divokého typu je stabilnější ve srovnání s Klíčová slova: Myší polyomavirus, HDAC6, acetylace, strukturní proteiny, posttranslační
|
|
|
Struktura minichromozomů polyomavirů
Satratzemis, Christos ; Forstová, Jitka (vedoucí práce) ; Mělková, Zora (oponent)
Genom polyomavirů se v hostitelské buňce nachází v podobě kruhové dvouvláknové DNA s nukleozomy. Exprese polyomavirových genů je tudíž ovlivněna rozmístěním nukleozomů na DNA a histonovými modifikacemi. Tato bakalářské práce shrnuje poznatky o struktuře polyomavirového minichromozomu a o efektech polohy nukleozomů a modifikací histonů na polyomavirový replikační cyklus. Práce zároveň popisuje faktory ovlivňující tyto jevy. Z dostupné literatury vyplývá, že pozice nukleozomů ani modifikace histonů nejsou náhodné, avšak ne všechny virové DNA molekuly jsou v těchto ohledech identické. Procesy jako časná a pozdní transkripce, replikace a enkapsidace tak probíhají pouze na určitých frakcích souboru molekul DNA.
|
|
|
Biologická léčba a její vliv na průběh latentních virových infekcí u pacientů s psoriázou
Laurin, Josef ; Šmahelová, Jana (vedoucí práce) ; Janovec, Václav (oponent)
Existuje přes 80 identifikovaných autoimunitních onemocnění. Mezi ty s nejvyšší prevalencí patří psoriáza, jejíž celosvětová prevalence se pohybuje okolo 2-5 %. Léčebné postupy tohoto zánětlivého onemocnění kůže lze rozdělit následovně: v případech nízké závažnosti se používají topické přípravky pro lokální léčbu a při jejich nedostatečném efektu se přistupuje k silnějším terapiím. Při střední závažnosti onemocnění je nasazována fototerapie a dále při středních až těžkých formách onemocnění se nasazuje léčba systémová. Mezi možnosti systémové terapie patří například cytostatikum metotrexát a imunosupresivum cyklosporin, případně retinoidy (analogy vitaminu A). Ani systémové terapie však nemusí mít žádaný efekt nebo mohou mít negativní vliv na celkový stav pacienta. V takových případech se využívá biologická léčba. Biologická léčba je obvykle prováděna protilátkami a fúzními proteiny, které jsou vyrobeny pomocí rekombinantních technologií. Pro léčbu psoriázy se používají nejčastěji inhibitory faktoru nádorové nekrózy α (TNF-α) a interleukinů 12, 17 a 23 (IL-12, IL-17 a IL- 23). Při inhibici imunitního systému biologiky bylo potvrzeno, že může docházet k reaktivaci virových infekcí. Ty mohou následně vést až k rozvoji onemocnění vyvolaných latentními virovými infekcemi.
|
|
|
Vlastnosti a funkce agnoproteinu polyomavirů
Zosinčuková, Tereza ; Forstová, Jitka (vedoucí práce) ; Vinšová, Barbora (oponent)
Čeleď pouze několik málo proteinů. Mezi tyto proteiny patří velký a malý T antigen a dále 2 až 3 strukturní proteiny označované jako VP1, VP2 a VP3. Někteří zástupci čeledi lidských polyomavirů je agnoprotein přítomen u BK polyomaviru a JC polyomaviru, což jsou původci některých vážných onemocnění u oslabeným imunitním systémem, kvůli čemuž jsou předmětem intenzivních výzkumů. Dále jej kóduje opičí virus SV40. Agnoprotein dokáže manipulovat hostitelskou buňkou, narušovat váčkový transport a také je klíčový pro virovou replikaci a transkripci. Hraje zřejmě důležitou roli při morfogenezi virionů, popřípadě při jejich uvolňování z buňky. Práce shrnuje nejnovější poznatky z oblasti vlastností a funkcí agnoproteinu BK polyomaviru, JC polyomaviru a viru SV40, se zaměřením na produkci tohoto proteinu během infekce, na jeho strukturu, posttranslační modifik buňce, interakční partnery a celkový význam tohoto enigmatického proteinu v replikačním cyklu
|
|
|
Targeting of viral nanoparticles to cancer specific receptors
Žáčková Suchanová, Jiřina
Úkolem této práce bylo prozkoumat potenciál umělých virových částic (virus-like particles, VLPs) odvozených od myšího polyomaviru (MPyV) jako možných nanonosičů pro řízenou dopravu terapeutických a diagnostických látek do specifických buněk či tkání. Vybrali jsme VLPs myšího polyomaviru, protože neobsahují virovou DNA a jsou považovány za bezpečné pro využití v bioaplikacích. Při našem výzkumu jsme použili přístup chemické modifikace pro přesměrování VLPs z jejich přirozeného receptoru na nádorové buňky. Lysinové zbytky exponované na povrchu částice byly modifikovány aldehydickým činidlem pro následnou konjugaci vybraných molekul, transferinu a inhibitoru glutamát karboxypeptidázy II (GCPII), na povrch částice. Transferin, transportér iontů železa do metabolicky aktivních buněk, pomohl k přesměrování VLPs do různých druhů nádorových buněk nadměrně produkujících transferinový receptor. Na druhou stranu, GCPII slouží jako transmembránový antigen specificky se vyskytující na buňkách nádoru prostaty a připojení malé molekuly inhibitoru k VLPs vedlo k úspěšnému rozpoznání těchto buněk. Použili jsme metodu elektronové mikroskopie k vizualizaci obou typů modifikovaných VLPs a metody průtokové cytometrie a konfokální mikroskopie pro studium specifických buněčných interakcí a internalizace nanočástic. Dále...
|
|
|
Targeting of viral nanoparticles to cancer specific receptors
Žáčková Suchanová, Jiřina ; Španielová, Hana (vedoucí práce) ; Němečková, Šárka (oponent) ; Ulbrich, Pavel (oponent)
Úkolem této práce bylo prozkoumat potenciál umělých virových částic (virus-like particles, VLPs) odvozených od myšího polyomaviru (MPyV) jako možných nanonosičů pro řízenou dopravu terapeutických a diagnostických látek do specifických buněk či tkání. Vybrali jsme VLPs myšího polyomaviru, protože neobsahují virovou DNA a jsou považovány za bezpečné pro využití v bioaplikacích. Při našem výzkumu jsme použili přístup chemické modifikace pro přesměrování VLPs z jejich přirozeného receptoru na nádorové buňky. Lysinové zbytky exponované na povrchu částice byly modifikovány aldehydickým činidlem pro následnou konjugaci vybraných molekul, transferinu a inhibitoru glutamát karboxypeptidázy II (GCPII), na povrch částice. Transferin, transportér iontů železa do metabolicky aktivních buněk, pomohl k přesměrování VLPs do různých druhů nádorových buněk nadměrně produkujících transferinový receptor. Na druhou stranu, GCPII slouží jako transmembránový antigen specificky se vyskytující na buňkách nádoru prostaty a připojení malé molekuly inhibitoru k VLPs vedlo k úspěšnému rozpoznání těchto buněk. Použili jsme metodu elektronové mikroskopie k vizualizaci obou typů modifikovaných VLPs a metody průtokové cytometrie a konfokální mikroskopie pro studium specifických buněčných interakcí a internalizace nanočástic. Dále...
|
host ::
RSS.