|
|
Využití molekulárně biologických technik pro identifikaci a analýzu probiotických bakterií
Konečná, Jana ; Doškař, Jiří (oponent) ; Kráčmar, Stanislav (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Izolace deoxyribonukleové kyseliny (DNA) je velmi důležitým krokem v molekulární diagnostice mikroorganismů. Pro amplifikaci DNA polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) je nezbytná vysoká kvalita izolované DNA. Izolace DNA pomocí konvenční fenol–chloroformové extrakce a srážení DNA ethanolem je časově náročná a vyžaduje použití toxického fenolu. Dalším způsobem izolace DNA je použití komerčně dostupných izolačních kitů, které jsou ovšem ekonomický náročné a neposkytují vysoké výtěžky. Magnetické separační techniky využívající magnetické pevné částice jsou jednou z moderních metod, které urychlují izolaci nukleových kyselin. Cílem této práce bylo ověřit použití dvou typů magnetických částic pro adsorpci DNA na pevnou fázi. Magnetické mikročástice P(HEMA – co – GMA) obsahující skupinu –NH2 a nanočástice PLL, které obsahují polylysin. Množství DNA v separační směsi bylo měřeno za použití ultrafialové spektrofotometrie (UV). Metoda byla testována nejprve na DNA z kuřecích erytrocytů. Pro adsorpci DNA na magnetické částice byl použit fosfátový pufr (pH 7, 7,6 a 8). Ukázalo se, že přibližně polovina DNA byla adsorbována na částice. Následně byly optimalizovány eluční podmínky a nakonec byla testována izolace bakteriální DNA a metoda byla použita k izolaci DNA z reálných vzorků potravinových doplňků stravy. Tato DNA eluovaná z částic byla v kvalitě vhodné pro PCR. Vysokorozlišovací analýza křivek tání (HRM) je jednoduchá a levná metoda, která je používána pro diskriminaci amplikonů po polymerázové řetězové reakci (PCR) v reálném čase. V této práci byla testována HRM-PCR pro rychlou identifikaci kmenů patřících do skupiny Lactobacillus. Byly použity tři různé metody izolace DNA: fenolová extrakce, separace pomocí magnetických částic a izolace pomocí komerčního kitu. K amplifikaci genu 16S rRNA bylo testováno 10 párů primerů pro cílové genové fragmenty (LAC1 - LAC2, LAC2 - LAC4, P1V1 - P2V1, Gro F - GroR, 3BA - 338f - Primer 1, V1F - V1R, CHAU - V3F - CHAU - V3R, CHAU - V6F - CHAU - V6R, poxcDNAFw - poxPromRVC, poxcDNAFw - poxPromRVT). Použitím párů primerů GroF/R a LAC2/4 byly úspěšně identifikovány druhy patřící do rodu Lactobacillus. Výsledky analýzy HRM – PCR ukazují rozdíly mezi sledovanými metodami extrakce použitými pro izolaci DNA.
|
|
|
Optimalizace izolace plazmidové DNA pomocí magnetických částic
Chlopková, Barbora ; Zemanová, Jana (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Teoretická část práce shrnuje poznatky ohledně izolace a přečištění plasmidové DNA a nukleových kyselin jako takových. Plasmidová DNA se používá často v genovém inženýrství jako vektor pro přenos určitého genu do buňky. Její izolace a přečištění v dostatečné kvalitě je klíčovou pro další procesy s tímto spjaté. V experimentální části byla zkoumána izolace a přečištění pDNA pomocí magnetických nosičů v přítomnosti různých koncentrací PEG 8000 v kombinaci s 1M NaCl. Dále byla zkoumána izolace pDNA pomocí komerčních kitů.
|
|
|
Izolace DNA z probiotických výrobků s využitím pevných nosičů
Bonczek, Ondřej ; Horák, Daniel (oponent) ; Rittich, Bohuslav (vedoucí práce)
Mikrobiální DNA byla izolována z hrubých lyzátů buněk rodu Lactobacillus a z probiotických výrobků. Bylo využito reverzibilní adsorpce DNA na neporézní magnetické částice poly(2-hydroxyethyl methacrylát-co-glycidyl methacrylát) - P(HEMA-co-GMA) pokryté karboxylovými skupinami a nanočástice manganatého Perovskitu, pokrytého silikagelem. DNA byla adsorbována na povrch částic v prostředí 16% PEG 6000 a 2M NaCl. Adsorbovaná DNA byla z částic uvolněna v nízkoiontovém TE pufru (pH= 8,0). Kvalita a koncentrace izolované DNA byla ověřena spektrofotometricky a amplifikací v PCR. Vzorky DNA izolované magnetickými částicemi a metodou fenolové extrakce (kontrola) byly amplifikovány v PCR. DNA izolovaná z hrubých lyzátů buněk probiotických výrobků byla kvantifikována s využitím kvantitativní PCR v reálném čase.
|
|
|
Fluorescenční detekce v analýze patogenů
Tomečková, Kristýna ; Kristýna, Zemánková (oponent) ; Bezděková, Jaroslava (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce se zabývá izolací a detekcí bakterií a to pomocí metody zvané molekulový imprinting ve spojení s fluorescenční mikroskopií. Teoretická část práce se soustřeďuje na porovnání vyvinutémetody s dosud využívanými metodami. Praktická část byla zaměřena na přípravu a optimalizaci molekulově imprintovaných polymerů na dvou různých nosičích – multititrační destičce a magnetických částicích. Jako otiskovaný templát byla vybrána bakterie Enterococcusfaecalis a její kompetitor bakterie Staphylococcus aureus.
|
|
|
Izolace DNA s použitím nově syntetizovaných magnetických nosičů
Machan, Radoslav ; Španová, Alena (oponent) ; Rittich, Bohuslav (vedoucí práce)
Teoretická časť práce bola zameraná na poskytnutie prehľadu základných vlastností magnetických častíc, ich morfológie, základných spôsobov ich syntézy, interakcie s DNA a aplikácie v oblasti biotechnológií a biomedicíny. Cieľom praktickej časti práce bolo overiť použitie novo navrhnutých magnetických častíc pri izolácii laktobacilovej DNA a DNA z teľacieho týmu. Na izoláciu DNA boli použité dva druhy magnetických nosičov: hypersieťované poly(glycidyl methakrylát-co-[2-(methakryloyloxy) ethoxy]octová kyselina-co-ethylen dimethakrylát) mikročastice pokryté amínovými skupinami - P(GMA-MOEAA-EDMA)-NH2 a magnetické neporézne magnetické poly(2-hydroxyethyl methakrylátové) mikročastice pokryté karboxylovými skupinami – P(HEMA-co-GMA)-COOH. Pre každý typ častíc boli testované dva odlišné postupy prípravy separačnej zmesi a dve rôzne koncentrácie poly(etylénglykolu) 6000 (PEG 6000) ako kondenzačného činidla. Medzi oboma typmi magnetických častíc boli zistené rozdiely pri izolácii DNA. Pri oboch typoch častíc bolo dokázané, že za podmienok izolácie pri koncentrácii PEG 6000 8 % sú vhodné na izoláciu DNA v kvalite vhodnej pre PCR.
|
|
|
Izolace DNA z vybraných zeleninových výrobků (paprika)
Gőghová, Sabína ; Kuderová,, Alena (oponent) ; Kovařík, Aleš (vedoucí práce)
Diplomová práce se zabývá mikroizolací rostlinné DNA z 10 různých technologicky zpracovaných potravinových výrobků obsahujících papriku (Capsicum annum). DNA v kvalitě vhodné pro PCR byla izolována z homogenátů připravených v lyzačním roztoku s CTAB pomocí magnetických částic PGMA funkcionalizovaných karboxylovými skupinami. Kvantita a kvalita DNA byla stanovena spektrofotometricky a ověřena metodami PCR s primery specifickými pro rostlinnou rDNA. Kvalita izolované DNA se lišila v závislosti na technologickém zpracování výrobků. DNA izolovaná z uzené mleté papriky a z tepelně ošetřených výrobků (s výjimkou jednoho výrobku) byla degradovaná a amplifikovala se jen s primery F_26S a R_26S (produkt PCR o velikosti 220 bp) na rozdíl od primerů F_18S a R_5.8S (produkt PCR 700 bp). DNA izolované z dalších potravinových výrobků se amplifikovaly s primery F_18S a R_5.8S (produkt PCR 700bp). PCR produkt z jedné mleté papriky (Žitavská paprika) byl klonován a sekvencován.
|
|
|
Diagnostika genomem podmíněných onemocnění za využití mikro a nanočástic
Mondeková, Věra ; Prášek, Jan (oponent) ; Provazník, Ivo (vedoucí práce)
Bakalářská práce pojednává o možnostech detekce virového genomu prostřednictvím biosenzorů, konkrétně pomocí magnetických částic. Úvodní část je tvořena stručnou charakteristikou virů, jakožto původců genomem podmíněných onemocnění, na kterou dále navazují kapitoly o vybraných metodách extrakce a analýz nukleových kyselin. Největší část je věnována magnetickým částicím. Praktická část se zabývá možností detekce specifické sekvence virulentního patogenu pomocí biosenzoru, výběrem biokompatibilních molekul vhodných k modifikaci magnetických částic a popisu postupu izolace specifické sekvence DNA pomocí magnetických částic.
|
|
|
Molekulární identifikace vybraných druhů bakterií mléčného kvašení a bifidobakterií v doplňcích stravy
Riegelová, Kristýna ; Rittich, Bohuslav (oponent) ; Španová, Alena (vedoucí práce)
Probiotické bakterie mléčného kvašení a bifidobakterie jsou přirozenou součástí gastrointestinálního traktu a v současnosti velmi využívané v potravinářském průmyslu ve formě potravinových doplňků. Cílem diplomové práce byla molekulární identifikace bakterií rodu Lactobacillus a Bifidobacterium v komplexních matricích dvou potravinových doplňků. DNA byla izolována z hrubých lyzátů buněk pomocí magnetických částic P(HEMA-co-GMA). Izolovaná DNA byla amplifikována v rodově a druhově specifických PCR. Amplikony byly detekovány pomocí agarózové gelové elektroforézy. Výsledky byly porovnány s údaji deklarovanými výrobcem ve třech různých šaržích.
|
|
|
Izolace DNA v kvalitě pro PCR z mléčných výrobků pro dětskou výživu
Mantlová, Jana ; Eva, Kvasničková (oponent) ; Španová, Alena (vedoucí práce)
Práce byla zaměřena na izolaci DNA v kvalitě pro polymerázovou řetězovou reakci (PCR) a identifikaci probiotických bakterií mléčného kvašení, které byly izolovány z pěti mléčných výrobků pro dětskou výživu. DNA byla z hrubých lyzátů buněk výrobku izolována pomocí magnetických mikročástic P(HEMA-co-GMA). Metodou fenolové extrakce byla izolována DNA z hrubých lyzátů buněk kontrolních kmenů, která byla využita jako pozitivní kontrola. Pomocí metod PCR byly ve výrobcích identifikovány DNA rodu Bifidobacterium a druhů B. animalis, B. bifidum, B. breve, B. infantis, B. longum a druhu Streptococcus thermophilus. Dosažené výsledky jsou v souladu s údaji deklarovanými výrobcem.
|
|
|
Identifikace vybraných druhů bakterií mléčného kvašení v mléčných výrobcích
Vystavělová, Růžena ; Trachtová, Štěpánka (oponent) ; Rittich, Bohuslav (vedoucí práce)
Bakterie mléčného kvašení jsou přirozenou součástí gastrointestinálního traktu člověka. Pro své probiotické účinky jsou často používány do doplňků stravy a pro výrobu fermentovaných mléčných výrobků. Diplomová práce byla zaměřena na identifikaci vybraných druhů bakterií mléčného kvašení a bifidobakterií v sýrech a mléčných výrobcích. Bakteriální DNA byla izolována pomocí magnetických částic P(HEMA-co-GMA) z hrubých lyzátů buněk 9 výrobků. Izolovaná DNA byla amplifikována pomocí rodově a druhově specifické polymerázové řetězové reakce (PCR). Získané amplikony byly detegovány agarózovou gelovou elektroforézou. Výsledky PCR byly porovnány s údaji uvedenými výrobcem a byla konstatována shoda.
|
host ::
RSS.