|
|
Reactive modifications of RNA for bioconjugations with proteins and new enzymatic methods for the synthesis of base-modified RNA
Brunderová, Mária ; Hocek, Michal (vedoucí práce) ; Míšek, Jiří (oponent) ; Vaňáčová, Štěpánka (oponent)
Tato disertační práce je zaměřena na enzymovou syntézu na bázi modifikovaných RNA s různými funkčními skupinami, včetně reaktivních pro síťování proteinů, hydrofobních a fluorescenčních skupin nebo afinitních značek. Konstrukce oligonukleotidů modifikovaných na bázi je zabezpečena buď konvenční in vitro transkripcí s T7 RNA polymerázou, nebo inovativním přístupem využívajícím upravené mutantní DNA polymerázy a reakci prodlužování primerů (PEX). V první části práce byl nasyntetizován nový ribonukleosid trifosfátový stavební blok s reaktivní chloracetamidovou funkční skupinou pomocí Sonogashirovy kaplingové reakce ve vodní fázi katalyzované Pd, přímo aplikované na jodovaný nukleotid. Chloracetamidem modifikovaný trifosfát byl poté testován jako vhodný substrát pro in vitro transkripci s T7 RNA polymerázou s cílem zkonstruovat RNA sondy s jednou nebo více reaktivními skupinami. Selektivita chloracetamidem modifikovaných RNA pro thiol, nebo cystein a histidin obsahující (bio)molekuly byla ukázána modelovými biokonjugačními reakcemi a experimenty pro síťování se třemi RNA-vazebnými proteiny s různými strukturami a funkcemi. Účinná tvorba kovalentních RNA-protein aduktů byla potvrzena western blotem, gelovou elektroforézou a hmotnostní analýzou, které byly prováděny za denaturačních podmínek....
|
|
|
Syntéza NIR Reduktivních Prób pro Monitoring Hypoxie Během Fungální Infekce
Kárníková, Tereza ; Baszczyňski, Ondřej (vedoucí práce) ; Míšek, Jiří (oponent)
Invazivní fungální infekce jsou velký problém. V jejich důsledku umírá po celém světě přibližně 1,5 milionu lidí ročně. Mezi nejčastější invazivní fungální infekce patří aspergilóza a kandidóza. Tyto oportunistické infekce mají vysoký podíl mortalit (50 % a 27 %). Diagnostika těchto infekcí bývá složitá. To často vede k jejich pozdějšímu odhalení a k většímu riziku vzniku komplikací. Pro diagnostiku a monitorování léčby fungálních infekcí se v poslední době zkoumají tzv. hypoxické sondy. Tyto sondy umožňují neinvazivní měření koncentrace kyslíku ve tkáních a mohou vést k časné diagnóze fungálních infekcí. Hypoxie může být také relevantním cílem pro doručení antifungálních látek. Z těchto důvodu byla připravena série hypoxicky-selektivních sond (prób). Sondy obsahují N-methyl-2-nitroimidazol, a fluorofor, který absorbuje v oblasti blízkého infračerveného spektra. Podle teorie mohou sondy fungovat následujícím způsobem: N-methyl-2-nitroimidazol, který se reduktivně rozkládá v hypoxickém prostředí, aktivuje sondu. Ta vyloučí fluorofor, který absorbuje v blízkém infračerveném spektru. Pomocí konfokální mikroskopie se bude sledovat, zda-li se fluorofor uvolnil selektivně v hypoxickém prostředí resp. v místě infekce. Klíčová slova: hypoxie, NIR, fluorescence, sonda, fungální infekce, fluorofor
|
|
|
Optimalizace stanovení koncentrací degradačních produktů uracilu pomocí LC-MS
Kavale, Gustav ; Ševčík, Jan (vedoucí práce) ; Míšek, Jiří (oponent)
V České republice podstupují ročně léčbu, jejímž základem jsou fluoropyrimidiny, desítky tisíc onkologických pacientů. Mnozí z těchto pacientů jsou postiženi negativními vedlejšími účinky, které můžou mít i fatální dopad. Aktuálně nejlépe popsaným faktorem příčiny toxicity fluoropyrimidinů je aktivita enzymem katabolismu pyrimidinů - dihydropyrimidin dehydrogenáza. Vzhledem k vysoké frekvenci patogenních mutací v genu pro dihydropyrimidin dehydrogenázu, se extrémní riziko toxicity týká v České republice ročně stovek pacientů. Z tohoto důvodu vydala "European Medical Agency" doporučení k provádění vyšetření možného výskytu toxických účinků před zahájením léčby. Jednou z diagnostických možností stanovení citlivosti na fluorouracil je metabolomická analýza, založená na kvantifikaci degradačních produktů metabolismu uracilu v plazmě pomocí kapalinové chromatografie s hmotnostní spektrometrií. Cílem této práce je provést základní optimalizaci parametrů hmotnostního spektrometru pro kvantifikaci vybraných degradačních produktů metabolismu uracilu. Klíčová slova: Uracil, Fluoruracil, Kapalinová Chromatografie, Hmotnostní spektrometrie
|
|
|
Malé molekuly jako imunomodulační látky v protinádorové terapii
Pavlovová, Anna ; Míšek, Jiří (vedoucí práce) ; Smrček, Stanislav (oponent)
Cílem této bakalářské práce bylo shrnout formou rešerše poznatky o několika vybraných terapeutických cílech pro imunoterapii nádorových onemocnění a malých molekulách, které na tyto cíle mohou imunomodulačně působit. Jedná se o poměrně nové a atraktivní téma v biomedicínských vědách, které se neustále vyvíjí. Některé malé molekuly jsou již schváleny k léčbě konkrétních nádorových onemocnění a celá řada malých molekul aktuálně prochází různými stádii klinických studií. Tato práce by měla poskytnout čtenáři přehled o možných přístupech k ovlivňování imunitního systému pomocí malých molekul. Klíčová slova: malé molekuly, imunoterapie, nádorová onemocnění, checkpoint inhibitory, nádorové mikroprostředí
|
|
|
Modification of nucleic acids by reactive groups for bioconjugations and cross-linking with lysine-containing peptides and proteins
Ivancová, Ivana ; Hocek, Michal (vedoucí práce) ; Míšek, Jiří (oponent) ; Urban, Milan (oponent)
V první části dizertační práce jsem vyvinula reaktivní DNA sondu pro selektivní cross- linkování s lysinovými zbytky DNA vazebních proteinů. Připravila jsem 2'-deoxycytidin 5'-O- monofosfát a trifosfát nesoucí v poloze 5 squramátovou skupinu navázanou přes propargylaminovou spojku. Monofosfát byl použit jako modelová sloučenina na testování reaktivity tohoto smíšeného squaramátu v cross-linkových reakcích s lysinem a krátkými peptidy obsahujícími lysin. Squaramátem modifikovaný 2'-deoxycytidin 5'-O-trifosfát byl dobrým substrátem pro KOD XL polymerázu pro enzymovou syntézu DNA metodou extenze primeru (PEX) a taky metodou polymerázové řetězové reakce (PCR). Squaramátem modifikovaná DNA tvoří stabilní diamidové vazby s primárními aminy. Reaktivitu modifikované DNA jsem testovala v biokonjugačních reakcích se sulfo-Cy5- aminem a s peptidy obsahujícími lysin. Poté byla squaramátem modifikovaná DNA úspěšně kovalentně připojena k histonovým proteinům bohatým na lysin. Reaktivní, squaramátem modifikovaný nukleotid vykazoval potenciál pro další biokonjugační reakce nukleových kyselin s aminy nebo lysin obsahujícími peptidy a proteiny bez potřeby externího činidla. Na základě pozitivních výsledků experimentů se squaramátem modifikovanou DNA, jsem v druhé části práce vyvinula a připravila squaramátem...
|
|
|
Novel fluorescent nucleotides for metabolic labelling and for the construction of DNA probes
Kuba, Miroslav ; Hocek, Michal (vedoucí práce) ; Slanina, Tomáš (oponent) ; Míšek, Jiří (oponent)
Cílem této dizertační práce byla syntéza nových nukleosidů, nukleotidů a příslušných DNA sond nesoucích různé fluorescenční značky pro bioanalytické aplikace. V první části práce byl pomocí Sonogashiry cross-kapling reakce syntetizován 2'-deoxycytidin a jeho trifosfát nesoucí imidazolinový fluorofor na bázi tryptofanu. Daný fluorofor vykazoval citlivost na pH a viskozitu. Nukleotid byl použit pro konstrukci modifikovaných oligonukleotidů (ON) a DNA prodlužováním primeru (PEX) nebo polymerázovou řetězovou reakcí (PCR). Značená ON sonda byla použita pro snímání interakce se single-strand vazebným proteinem, což vedlo ke zvýšení intenzity fluorescence modifikovaného ON. Dále byl připraven thymidin a thymidin-5'-O-trifosfát, nesoucí benzyliden- tetrahydroxanthyliový fluorofor, pomocí mědí katalyzované azid-alkynové cykloadice (CuAAC). Fluorescence fluoroforu je závislá na polaritě a viskozitě prostředí. Inkorporace modifikovaného nukleotidu do DNA pomocí PEX nebo PCR vedlo k dramatickému zvýšení fluorescence, pravděpodobně díky interakcím fluoroforu ve velkém žlábku. Bohužel, modifikovaný nukleotid nebyl vhodný pro vizualizace v buňkách kvůli své cytotoxicitě. Modifikovaná dsDNA byla použita jako fluorescenční sonda pro snímání interakcí s malými molekulami a proteiny změnou fluorescence. Nakonec byl...
|
|
|
Oxidační posttranslační modifikace a jejich význam
Šimková, Anna ; Míšek, Jiří (vedoucí práce) ; Petrák, Jiří (oponent)
Aerobní způsob života s sebou přináší nevyhnutelné vystavení živých systémů reaktivním formám kyslíku, dusíku a chloru. Široká škála oxidantů může měnit strukturu biomolekul, jako jsou proteiny, lipidy a DNA. Oxidační posttranslační modifikace hrají důležitou roli v řadě buněčných procesů, například se účastní redoxní signalizace, transkripce genů a metabolismu. Nárůst oxidantů v buňkách vede k oxidačnímu stresu, který je u lidí spojen se vznikem neurodegenerativních, kardiovaskulárních a autoimunitních onemocnění. Výzkum zaměřený na působení konkrétních reaktivních druhů v buňce může objasnit spletitou síť redoxních dějů a pomoci vývoji odvětví redoxní medicíny.
|
|
|
Vývoj syntetické metodiky pro přípravu pokročilých cykloarenů a jejich analogů
Bambas, Daniel ; Stará, Irena (vedoucí práce) ; Míšek, Jiří (oponent)
Tato Bakalářská práce se zabývá návrhem struktury a pokusy o přípravu vhodných stavebních bloků pro výstavbu makrocyklu s dalším využitím v syntéze cykloarenů. V Teoretickém úvodu jsou shrnuty dosavadní pokroky v přípravě [n]cirkulenů a látek na bázi kekulenu s důrazem na "kruhotvorné" reakce, které je možné použít ve finálních krocích jejich přípravy. V části Výsledky a diskuze jsou představeny snahy o přípravu vybraného stavebního bloku jako výchozí látky pro vybudování makrocyklu, jehož transformace s využitím [2+2+2] cyclotrimerizace jako "kruhotvorné reakce" by měla vést k vybranému cykloarenu. Část Navrhované alternativy syntéz a diskuze o dalším postupu předkládá návrhy, kam by se mohla tato studie dále ubírat. Experimentální část podává praktické informace o provedených experimentech a charakterizaci připravených sloučenin.
|
|
|
Využití tandemové cyklizace/Sonogashirova couplingu v syntéze přírodních látek a jejich derivátů
Liška, Benno ; Matoušová, Eliška (vedoucí práce) ; Míšek, Jiří (oponent)
Předmětem této bakalářské práce je příprava polycyklických sloučenin pomocí tandemové cyklizace/Sonogashirova couplingu a možné využití této reakce v syntéze přírodních látek a jejich derivátů. Cílem bylo studovat tuto metodu s nearomatickými výchozími látkami se šestičlenným kruhem a zkoumat možnosti funkcionalizace trojné vazby nově připravených sloučenin. První část této práce se zabývá syntézou výchozích látek obsahujících buď etherovou skupinu nebo malonátový zbytek. Druhá část se věnuje optimalizaci podmínek a studiu rozsahu Heckovy reakce a Sonogashirova couplingu. Třetí část popisuje pokusy o hydrataci trojné vazby a poslední část pak obsahuje reakce s allylovými alkoholy. Klíčová slova: syntéza, tandemová reakce, přírodní látky, Sonogashirův coupling, Heckova reakce
|
|
| |
host ::
RSS.