|
Metoda pro studium oxidačního stresu onkologických pacientů pomocí průtokové injekční analýzy s elektrochemickou detekcí
Zítka, Ondřej ; Bořek Dohalská, Lucie (oponent)
Název práce: Metoda pro studium oxidačního stresu onkologických pacientů pomocí průtokové injekční analýzy s elektrochemickou detekcí ABSTRAKT Oxidační poškození organismu a jeho mechanismy jsou jedním z dlouhodobých cílů studia v oblasti biochemie. Látky způsobující toto poškození, kde jsou nejčastěji skloňovány kyslíkové radikály, působí na molekuly v organismu včetně těch nejdůležitějších biomolekul jako DNA. Díky tomu dochází k přeměnám nukleových bazí v samotném řetězci nukleotidů na jejich analogy a tím může být pozměněna funkčnost genetického kódu, což může vyústit v patologické jevy. Cílem této práce je ukázat vhodnost využití elektrochemických metod pro citlivou detekci produktů oxidace nukleových kyselin jako markeru oxidačního poškození. S využitím metod jako ELISA, průtokový injekční systém a magnetické nanočástice byl navržen senzor pro detekci 8-OHdG jako marker oxidace nukleových kyselin u onkologických pacientů, který byl následně úspěšně aplikován. Pomocí vyvinuté metody byly zanalyzovány vzorky moči u čtrnácti pacientů trpících rakovinou prostaty, kde jsme byli schopni rozdělit pacienty do tří úrovní podle detekované koncentrační hladiny 8-OHdG. Celá metoda je nejen dostatečně citlivá, ale také vhodná pro účely aplikace do mikrofluidního zařízení zvaného "Lab on a chip". Metoda a její...
|
|
Moderní terapie cystické fibrózy
Křesťan, Jan ; Bořek Dohalská, Lucie (vedoucí práce) ; Hudeček, Jiří (oponent)
Cystická fibróza je autozomálně recesivní onemocnění, které je způsobeno mutacemi v CFTR genu. Cílem práce je shrnutí zjištěných skutečností z oblasti léčby cystické fibrózy CFTR modulátory. V první části práce je popsáno samotné onemocnění, jeho historie a příznaky. Rovněž jsou zde uvedeny příčiny onemocnění, a to formou popisu CFTR genu a mutací, které vedou k onemocnění cystickou fibrózou. V práci je rovněž popsána funkce CFTR proteinu. Dále se práce věnuje symptomatické léčbě a zmiňuje genovou terapii. Druhá část práce shrnuje aktuální poznatky o léčbě CFTR modulátory. Rozděluje tyto sloučeniny dopěti skupin na CFTR potenciátory, korektory, amplifikátory, stabilizátory a read- through agents. V poslední části práce je nastíněn pohled do budoucna vzhledem k modulátorovým terapiím, které jsou ještě ve vývoji.
|
|
Interakce bakteriálních lektinů s epitelem lidských plic
Vyhnalová, Kateřina ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Bořek Dohalská, Lucie (oponent)
Cystická fibróza (CF) je autozomálně recesivní onemocnění způsobené mutacemi v genu CFTR (z angl. cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) kódujícího stejnojmenný chloridový kanál, který je přítomen na apikální membráně epiteliálních buněk. Důsledkem těchto mutací je narušen transepiteliální transport iontů a regulace dalších iontových kanálů. Cystická fibróza primárně postihuje respirační systém, kde v důsledku dysfunkce CFTR proteinu dochází k akumulaci nadměrně viskózního hlenu a ke změnám glykosylace sacharidových struktur na povrchu plicního epitelu. Tento patologický stav predisponuje pacienty s CF k bakteriálním infekcím plic, které jsou hlavní příčinou úmrtí pacientů s CF. Nejčastějším patogenem kolonizujícím respirační systém pacientů s CF je Pseudomonas aeruginosa (PA). Pro adhezi na hostitelskou tkáň PA využívá řadu faktorů virulence, včetně lektinu PA-IIL, který se vyznačuje nezvykle vysokou afinitou k L-fukose. V této práci byl studován vliv vybraných monosacharidů a multivalentních inhibitorů na bázi fukosy (glykoklastrů) na vazbu PA-IIL na epitel lidských plic. Pro zkoumání účinku daných agens ex vivo byly použity do parafinu zalité tkáně lidských plic fixované formalinem (FFPE tkáň; z angl. formalin-fixed paraffin-embedded tissue) zdravého jedince a pacienta s CF. Lektin...
|
|
Charakterizace pankreatických beta-buněk po jejich stimulované proliferaci syntetickými modifikovanými mRNA
Veľasová, Adriana ; Koblas, Tomáš (vedoucí práce) ; Bořek Dohalská, Lucie (oponent)
Diabetes mellitus je chronické onemocnění způsobené ztrátou beta-buněk slinivky břišní, ke které dochází v důsledku autoimunitní destrukce, či zvýšené apoptózy beta-buněk. Nedostatek beta-buněk má za následek sníženou produkci insulinu, který hraje významnou roli v metabolismu glukosy. Počet beta-buněk organismu je jedním z hlavních faktorů, který ovlivňuje vznik tohoto chronického onemocnění. Z tohoto důvodu bylo vhodné nalézt způsob, pomocí kterého by bylo možné počet beta-buněk organismu navýšit a obnovit tak přirozenou cestou produkci insulinu bez jakékoliv nutnosti využívání insulinových infuzí. Schopnost buněčného dělení beta-buněk ovšem s věkem klesá a v dospělosti je prakticky nulová. Nadějnou cestou k obnově insulin produkující tkáně se tak jeví studium buněčného cyklu beta-buněk, především poté časných a pozdních cyklinů a cyklin dependentních kinas, které působí jako regulátory buněčného cyklu. S cílem zvýšit počet beta-buněk vstupujících do buněčného cyklu jsme se zaměřili na studium vlivu in vitro připravených (IVT) mRNA cyklinů typu D a cyklin dependentních kinas 4 a 6 na stimulaci buněčného dělení izolovaných beta-buněk. Zjistili jsme, že transfekce IVT mRNA pro cykliny typu D v kombinaci s cyklin dependentními kinasami 4 a 6 výrazně zvyšuje proliferaci beta-buněk uvězněných v klidové fázi...
|
| |
|
Heterologní exprese a purifikace lidského cytochromu b5
Kostelanská, Marie ; Černá, Věra (vedoucí práce) ; Bořek Dohalská, Lucie (oponent)
Při metabolismu xenobiotik a endogenních látek se uplatňuje monooxygenasový systém, jehož součástí je i cytochrom b5 participující na katalytické činnosti cytochromů P450 (CYP). Mechanismus působení cytochromu b5 v tomto souboru enzymů však nebyl doposud zcela objasněn. Předpokládá se, že se buď přímo podílí na přenosu elektronů v rámci monooxygenasového systému, nebo může alostericky působit na konformaci CYP. Proto je důležité získat co nejčistší apoformu cytochromu b5, která není schopna přenosu elektronů, a dále studovat vliv této nehemové formy cytochromu b5 na činnost CYP. Získané výsledky pak mohou přispět k poznání mechanismu působení cytochromu b5. V průběhu této práce byla provedena transformace bakteriálního kmene buněk Escherichia coli BL-21 (DE3) Gold expresním vektorem pET22b, který nesl geny pro mikrosomální a erytrocytární formu cytochromu b5. Za účelem produkce vysokého podílu apoproteinové formy byla heterologní exprese cytochromu b5 indukována vyšším přídavkem IPTG a byla provedena při 37řC. Tato bakalářská práce se pak zabývá zejména purifikací jak mikrosomální, tak i erytrocytární formy cytochromu b5 a to hlavně jeho apoformy. Jelikož však při expresi dochází vždy ve větší či menší míře i k produkci hemové formy cytochromu b5, byla i ta izolována. Holo- a apoproteinová forma...
|
| |
|
Studium úlohy biotransformačních enzymů v chemické karcinogenezi
Kondrová, Eliška ; Souček, Pavel (vedoucí práce) ; Skálová, Lenka (oponent) ; Vobořilová, Jana (oponent) ; Bořek Dohalská, Lucie (oponent)
Biotransformační studie in vitro jsou nezbytnou součástí toxikologického výzkumu i vývoje nových léčiv, nebo umožňují významnou měrou snížit počet testů na lidských dobrovolnících a poskytují detailnější informace o metabolismu studované látky. Díky limitované dostupnosti lidské jaterní tkáně je pro studium interakcí biotransformačních enzymů s xenobiotiky třeba využívat alternativní modelové systémy a modelové zvířecí druhy. Vzhledem k tomu, že u nejběžnějšího laboratorního druhu, potkana, nejsou přítomny aktivity nejvýznamnějších lidských biotransformačních enzymů, velmi přínosné mohou být informace získané s použitím miniprasat jako modelového druhu. Rekombinantní lidské biotransformační enzymy exprimované v bakteriálních buňkách mohou být použity ke studiu biotransformace ve formě izolovaných bakteriálních membrán. Tyto systémy poskytují informace o metabolismu studované látky definovaným enzymem, jejich výhodou oproti izolovaným enzymům je přitom nízká cena a snadnější a rychlejší příprava s menšími ztrátami enzymové aktivity během izolace. Cílem práce bylo: 1) Připravit modelový systém s lidskými biotransformačními enzymy exprimovanými v bakteriálních membránách a porovnat vlastnosti tohoto systému s jaterními mikrosomy pokusných miniprasat. Zhodnotit možné využití těchto dvou systémů pro testování...
|
|
CFTR-mRNA: alternativa pro genovou terapii cystické fibrózy
Pecková, Kateřina ; Bořek Dohalská, Lucie (vedoucí práce) ; Nosková, Libuše (oponent)
Cystická fibróza je onemocnění, u kterého dochází k mutaci CFTR genu kódujícího stejnojmenný protein, jehož hlavní funkcí je přenos chloridových iontů. K napravení tohoto defektu byla v rámci diplomové práce vybrána genová terapie. Byly syntetizovány dva typy stabilní mRNA obsahující minimálně 200 adeninů na 3' konci, 25 % pseudouridinu, 25 % 5-methylcytidinu a na 5' konci buďto klasickou čepičku (enzymová mRNA) nebo analog čepičky 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G (tzv. ARCA mRNA). Byly použity buněčné linie od zdravých jedinců (NuLi-1) a pacientů trpících cystickou fibrózou s mutací F508del (CuFi-1). Vizualizace CFTR proteinu pomocí optimalizované metody nepřímé imunofluorescence potvrdila zvýšení exprese CFTR proteinu u obou buněčných linií CuFi-1 a NuLi-1, a to jak při použití ARCA mRNA tak při použití enzymové mRNA. Funkčnost CFTR proteinu byla stanovena prostřednictvím fluorescenčního barviva N-(ethoxycarbonylmethyl)-6-methoxychinolinu (MQAE), kterým byly buněčné linie předem obarveny a které je specificky zhášeno halogenovými ionty. Transport iontů skrze tento kanál byl ověřen použitím CFTR(inh)-172, který specificky tento kanál inhibuje svou vazbou na R doménu. Po 24h transfekci ARCA mRNA buněčné linie CuFi-1 došlo k obnově jeho funkce. V neposlední řadě byla studována adheze bakterií Pseudomonas...
|
| |