|
|
Influence of natural polyphenolic substances on p53 protein expression
Bušanski, Patrik ; Němcová, Andrea (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
The tumor suppressor protein p53 is one of the major regulators of the cell cycle after DNA damage. In addition to stopping the cycle and repairing DNA, it can, in extreme cases, induce programmed cell death - apoptosis. Mutations in the gene encoding p53 are present in more than 50% of cancer cases. This thesis examines alternative natural polyphenolic substances that could increase the level and expression of p53 protein in tumor cells. These substances could be an alternative to non-specific cytostatics, which bring many undesirable additional effects during treatment. In the theoretical part of the thesis the structure and properties of the p53 protein and describes alternative therapeutic approaches with a focus on polyphenolic substances is explained. The aim of the experimental part was to determine the effect of curcumin and resveratrol in comparison with often used cytostatic drug, doxorubicin, on cell viability of tumor cells and on p53 protein levels. The effect of these substances on the binding of p53 to DNA in yeast systems was also examined. It was found that doxorubin efficiency is many times higher than the examined polyphenolic agents, but resveratrol was showing some potential as a suitable alternative in the treatment of tumors, thanks to the ability to activate apotosis. It was clearly demonstrated that there is an association between induced programmed death and increased p53 protein expression after resveratrol treatment.
|
|
|
Use of some molecular techniques to metabolic characterization of industrially significant yeasts
Kostovová, Iveta ; Brázda, Václav (oponent) ; Kráčmar, Stanislav (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
Carotenoids, ergosterol and fatty acids are valuable compounds used in food, feed and cosmetic industries. Since their conventional sources depend on weather conditions, season, geographical location, and availability of agricultural land, it is necessary to increase its availability for constantly increasing demand. Microbial production of aforementioned compounds exploiting carotenogenic yeast is promising due to their extraordinary capability to simultaneously produce carotenoids, ergosterol and fatty acids. Hereby Doctoral Thesis was aimed to provide the molecular and metabolic characterisation of various carotenogenic yeasts and their potential for industrial applications. For this purpose, the first experimental parts are focused in great detail on yeast species R. mucilaginosa and R. toruloides, their production properties and the influence of nutritional stress and different carbon sources, such as xylose and glycerol. Besides the detailed characterization of their production properties, were these strains also characterized by molecular methods, including sequence analysis of ITS1, ITS2 and D1/2 of the ribosomal operon and analysis of mini and microsatellite sequences M13 and GTG5. R. toruloides is known as an excellent producer of fatty acids and because of it, it recently became a target carotenogenic yeast for the development of tools for its genetic manipulation. In this work were successfully prepared genetically modified clones of R.toruloides bearing over-expressed genes for DGA1 (diacylglycerol acyltransferase) and GPD1 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase). Their production of fatty acids was not higher in comparison to the original strain. Therefore, the next part was focused on the preparation of overproducing mutant strains prepared by random mutagenesis. The combination of nitrogen limitation and the carotenoid production inhibitor diphenylamine led to the successful selection of carotenoid overproducing robust mutant strains with resistance to diphenylamine. The last part of the thesis deals with the production properties of lesser known carotenogenic yeast species among order Sporidiobolales and Cystofilobasidales in comparison to relatively well studied carotenogeic yeast species represented by R. toruloides and P. rhodozyma. The best fatty acid-producing strains were S. metaroseus CCY19-6-20 and C. macerans CCY 10-01-02. Moreover, the best carotenoid producer, R.mucilaginosa CCY 19-04-06, naturally produced lycopene in amounts representing more than 80 % of total carotenoids.
|
|
|
Analýza inverzních repetic v genomu lidských patogenů
Hanzlíková, Anna ; Nováčková, Ivana (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Patogeny jsou organismy, které jsou příčinou různých onemocnění hostitele. Patří zde: priony, viry, bakterie, houby, prvoci a živočichové. Tato bakalářská práce je zaměřená konkrétně na viry, způsobující lidská onemocnění jako jsou závažné respirační syndromy, onemocnění jater či rakovina děložního čípku. Cílem této bakalářské práce bylo pomocí webové aplikace Palindrome analyser charakterizovat přítomnost a umístění inverzních repetic v genomech organismů, které jsou patogenní pro lidský organismus. Byly vybrány 4 viry, z nichž dva jsou ze skupiny DNA virů a dva ze skupiny RNA virů. S ohledem na propuknutí pandemie na začátku roku 2020, kterou způsobil virus SARS-CoV-2, je v této bakalářské práci zařazen. Z RNA virů byly tedy vybrány: SARS-CoV a SARS-CoV-2. Z DNA virů byly vybrány: virus Hepatitis B a lidský papilomavirus. Sekvence virových genomů byly získány z databáze NCBI (National Center for Biotechnology). Poté byly pomocí programu Palindrome analyser, který je dostupný online, analyzovány všechny čtyři viry na přítomnost inverzních repetic, jejich polohu a velikost. Největším genomem byl SARS-CoV-2 s velikostí 29 903 bp, který měl zároveň nejvíce inverzních repetic.
|
|
|
Analýza změn genomu C. necator po evoluční adaptaci
Kroupa, Štěpán ; Obruča, Stanislav (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Tato práce se zabývá analýzou mutačních změn bakteriálních populací Cupriavidus necator H16 po evoluci za různých stresových podmínek. Tato analýza byla provedena zpracováním dat z metody sekvenování genomu „Next Generation Sequencing“, která byla provedena externí společností DNALink. Na základě bioinformatického postupu byl sestaven seznam mutačních změn pro každou adaptovanou populaci. Dále byly stanovené mutační změny asociovány s konkrétními oblastmi referenčního genomu Cupriavidus necator H16 z NCBI a analyzovány dle dostupných informací. Na závěr byl diskutován případný vliv stanovených mutací na produkci zásobních polymerů polyhydroxyalkanoátů.
|
|
|
Aflatoxiny v potravinách a jejich vliv na DNA a buněčné linie
Šislerová, Lucie ; Pernicová, Iva (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Aflatoxiny představují kvůli jejich vysoké toxicitě a karcinogenitě velké nebezpečí, kterému se v běžném životě snadno nevyhneme. Intoxikace aflatoxiny způsobuje velkou řadu onemocnění od těch lehčích až po nekrózu orgánů či smrt. Nejvíce aflatoxiny postihují játra, kde dochází k jejich odbourávání a vzniku následných metabolitů, které jsou pro tělo nejtoxičtější. Z tohoto důvodu je jejich přesné stanovení a porozumění principu jejich účinků velmi důležité. V práci byly kalibrovány metody pro sledování a k bližšímu určení vlivu aflatoxinů na lidské buňky. K tomuto sledování byly použity metody: MTT testy viability, fluorescenční mikroskopie a průtoková cytometrie. Jako další bylo proměřeno množství přítomných aflatoxinů v různých potravinách s odlišnými podmínkami skladování. Pro tuto analýzu byly použity ELISA testy RIDASCREEN Aflatoxin Total a RIDA Aflatoxin column. Kalibrované metody byly porovnány s metodami již používanými pro stanovení vlivu aflatoxinů a výsledky ELISA testů byly porovnány s limity množství aflatoxinů povolenými Českou legislativou. Žádná z kontrolovaných potravin neobsahovala nadlimitní koncentraci aflatoxinů, která je v České republice stanovena na 4-10 µg/l (liší se pro různé druhy potravin). Nejvyšší hodnoty aflatoxinů vykazovaly potraviny, které byly špatně skladovány ale nebyly viditelně napadeny plísněmi. Byla stanovena hodnota LD50 pro aflatoxin B1 na 12,25 µM. Pomocí průtokové cytometrie byl stanoven druh buněčné smrti, kterou aflatoxin způsobil a tato data byla dále potvrzena díky snímkům z fluorescenční mikroskopie.
|
|
|
Analysis of C. necator genome changes after evolutionary adaptation
Vojsovič, Matúš ; Šedrlová, Zuzana (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
The p53 protein is a transcription factor that belongs to the group of the tumour suppressor proteins. p53 functions include cell cycle regulation, interaction with DNA, and responses to damaged DNA that may lead to apoptosis or even senescence may occur. The theoretical part summarizes the latest information about the chemical structure and functions of the protein p53 and allosteric modifications that the p53 protein may possess in cells. It also describes selected methods of isolation and characterizes proteins. The aim of the experimental part was to isolate and characterize -isoforms of the p53 protein, which were isolated from the microorganism E.coli. Protein production was preceded by preparation and transformation of plasmids into production cells. From the production cells, 4 -isoforms of p53 were isolated by affinity chromatography, due to the polyhistidine anchor that the proteins contain. The isolated proteins were subsequently characterized by SDS-PAGE and western blotting. Moreover, the transactivation potential in the yeast system was monitored by luciferase assay under conditions involving the use of various culture media, as well as expressed or coexpressed under the inducible GAL1 promoter and the constitutive GPD promoter.
|
|
|
Molekulárně biologická charakterizace vybraných producentů PHA
Kubáčková, Eliška ; Brázda, Václav (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Diplomová práce se zabývá molekulárně biologickou charakterizací vybraných producentů polyhydroxyalkanoátů (PHA). V rámci práce byly pomocí molekulárně biologických metod identifikovány a charakterizovány PHA produkující termofilní izoláty pocházející ze vzorků aktivovaného kalu a kompostu. Sekvenací 16S rRNA genu byly termofilní izoláty identifikovány a taxonomicky zařazeny do kmene bakterií Firmicutes. U těchto bakteriálních izolátů byla stanovena schopnost produkce PHA na úrovni genotypu pomocí konvenční PCR detekcí phaC genu kódujícího PHA syntázu, který je klíčovým enzymem biosyntézy PHA. U většiny izolovaných bakterií byly detekovány PHA syntázy I., II. a IV. třídy, přičemž PHA syntázy tříd I a II nejsou pro detekované rody bakterií charakteristické. Největšího zastoupení izolátů představoval druh termofilní bakterie Aneurinibacillus thermoaerophilus, u kterého byla detekována PHA syntáza IV. třídy. V druhé části diplomové práce byla zavedena metoda RT-qPCR pro studium exprese vybraných genů bakterie Cupriavidus necator H16 zapojených do metabolismu PHA. V rámci zavedení metody byla provedena optimalizace PCR detekce vybraných genů a optimalizována kvantifikace genů pomocí real-time PCR. Testovaná metoda zahrnovala kroky izolace RNA, syntézu cDNA a kvantifikaci úseků genů, u nichž byly na základě získaných dat stanoveny kritické body metody.
|
|
|
Optimization of p53 mutant protein isolation and its DNA binding properties
Osadchuk, Olha ; Zemanová, Jana (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
P53 protein is one of the most important molecules in the human body. It is responsible for several cellular processes such as DNA repair, cell cycle or induction of apoptosis. P53 is also known as “guardian of the genome”. DNA binding ability of p53 is important for the normal cell development and growth. Different mutation of TP53 gene, may cause lost of p53 binding ability andits tumor suppressor function that may lead to the cancer development. The theoretical part of this diploma thesis, is focused on the characterization of main properties, function and mechanism of p53 protein activation and description oflocal secondary DNA structures. The main goal of the experimental part was production of four mutant forms of p53 protein and wild-type p53 protein and studying its binding properties with different local secondary DNA structures. Using Gateway cloning system, four expression vectors were prepared and used for protein production in the bacterial expression system. In total, four mutant and one wild-type p53 protein were prepared and their DNA binding properties were evaluated by Electrophoretic Mobility-Shift Assay The results suggest different DNA-binding properties of wild-type p53 and mutant forms of this protein. All studied mutant proteins lost ability to bind DNA sequence specifically, whereas non- specific interaction with DNA were sustained for three out of four mutant forms. One of the studied mutant proteins showed preference for superhelical form of DNA.
|
|
|
Izolace a analýza DNA se zaměřením na mikroorganismy důležité v potravinářství
Čutová, Michaela ; Obruča, Stanislav (oponent) ; Fojtová,, Miloslava (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Identifikace bakteriální DNA se skládá z několika kroků: lyze buněk, izolace a purifikace DNA, precipitace ethanolem a identifikace bakteriálního kmene pomocí PCR, případně i jiných molekulárně biologických metod. Každý krok musí být optimalizován. Nukleové kyseliny lze z buněk s výhodou izolovat pomocí magnetických nosičů. Molekuly DNA jsou na povrch magnetického nosiče navázány na základě elektrostatických interakcí a posléze jsou eluovány do pufru. Cílem práce bude optimalizace jednotlivých kroků identifikace bakteriální DNA: buněčná lyze, izolace DNA, charakterizace pevných magnetických nosičů funkcionalizovaných aminoskupinami pro izolaci nukleových kyselin. Přítomnost DNA v eluátu bude ověřena pomocí gelové agarosové elektroforézy a množství eluované DNA bude stanoveno spektrofotometricky. Kvalita izolované DNA bude bude ověřena její amplifikací s použitím polymerázové řetězové reakce (PCR). Dále je práce zaměřena na studium sekundárních struktur nukleových kyselin – křížových struktur a kvadruplexů. Tyto struktury se podílí na regulaci buněčných procesů a jejich výskyt je spojován s vývojem onkologických a neurodegenerativních onemocnění. Byla provedena analýza genomu in silico u mikroorganizmů významných v potravinářském průmyslu. Sevence genomů mikroorganismů byly získány z databáze NCBI (National Center for Biotechnology). Pro analýzu byl použit software Palindrome Analyser a G4 Hunter.
|
|
|
Comparison of biotechnological procedures for pure proteins preparation
Bušanski, Patrik ; Langová, Denisa (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
The production of recombinant proteins is a biotechnological process during which proteins are produced in foreign organisms by gen manipulation. To form a recombinant plasmid the gene encoding the desired protein is isolated and inserted into an expression vector. The plasmid is then transformed using physical or chemical method into a suitable host, where the recombinant gene is translated into amino acid sequence in the newly synthetized protein. The theoretical part of this bachelor thesis includes characteristics of proteins, methods of recombinant protein preparation and compares individual expression systems. Three isoforms of the p53 protein, which were synthesized in the E. coli microorganism, were selected for processing the experimental part. The transformed recombinant plasmid contained two tags for purification, HIS-tag and GST-tag, making it possible to compare the efficacy of the two purification methods. HIS-tag purification was found to work for all three isoforms better, with concentrations of recombinant proteins were several times higher than those of the GST-tag. The p53 proteins are about 50 kDa long, what was confirmed by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis.
|
host ::
RSS.