|
|
Effect of amino acid alphabet reduction on structure and function of dephosphocoenzyme A kinase
Makarov, Mikhail ; Hlouchová, Klára (vedoucí práce) ; Dračínská, Helena (oponent)
Je dobře známo, že velká rozmanitost proteinových funkcí a struktur je umožněna širokým spektrem fyzikálně-chemických vlastností 20 standardních aminokyselin, které tvoří moderní proteiny. Podle obecně přijímané koevoluční teorie genetického kódu, evoluce proteinových struktur a funkcí byla nepřetržitě spojena s rozšiřováním genetického kódu, přičemž aromatické aminokyseliny jsou považovány za nejvíce pozdní členy genetického kódu. Jejich inkorporace zřejmě přispěla ke zvýšení strukturní stability proteinů a diverzifikaci jejich katalických funkcí. Hlavním cílem této diplomové práce bylo otestovat, zda enzymová katalýza mohla předcházet inkorporaci aromatických aminokyselin do standardního genetického kódu. Pro tento účel byl prozkoumán vliv redukce aminokyselinového repertoáru na strukturu a funkci defosfokoenzym A kinasy (DPCK). Defosfokoenzym A kinasa katalyzuje poslední krok v biosyntéze koenzymu A, což je evolučně vysoce konzervovaný kofaktor. V této práci byly navrženy dva mutantní proteiny DPCK z termofilní bakterie, Aquifex aeolicus, tak, aby aromatické aminokyseliny byly nahrazeny (i) leuciny a (ii) nearomatickými aminokyselinami pro co největší zachování strukturní stability proteinu. Přirozená varianta (z angl. wild type) proteinu a dva mutantní proteiny postrádající aromatické...
|
|
|
Biofyzikální charakterizace proteinových knihoven z různých repertoárů aminokyselin
Neuwirthová, Tereza ; Hlouchová, Klára (vedoucí práce) ; Ptáček, Jakub (oponent)
Tato diplomová práce je součástí projektu zabývajícího se evolucí genetického kódu společně se studiem struktury a případné funkce prebiotických proteinů. Repertoár aminokyselin v prvotních proteinech se pravděpodobně v čase měnil a měl tak vliv na vývoj struktury a funkce bílkovin. Prvotní aminokyselinová abeceda byla zřejmě pouze poloviční velikosti dnešní aminokyselinové abecedy a pravděpodobně obsahovala pouze deset z dnešních dvaceti aminokyselin. Zmiňovaných deset aminokyselin bylo prebioticky dostupných převážně ze dvou typů potenciálních zdrojů, endogenních a exogenních. Cílem této práce je příprava (s využitím bezbuněčné exprese) a purifikace dvou randomizovaných proteinových knihoven (obsahujících zhruba 1011 variant) s různým aminokyselinovým složením, a následné srovnání tendence k tvorbě sekundárních a terciárních struktur. Knihovna první totiž obsahuje pouze deset prebioticky dostupných aminokyselin, knihovna druhá všech dvacet, které dnes tvoří genetický kód. Tento projekt by měl pomoci odhalit, jaký přínos mělo zabudování jednotlivých aminokyselin pro vznik struktury bílkovin. Celý výzkum by tak teoreticky mohl přispět k zodpovězení základních otázek nejen z oboru proteinové evoluce, ale i syntetické biologie či proteinového inženýrství. Klíčová slova: proteinové knihovny,...
|
|
|
Strukturní NMR studie proteinových komplexů
Hexnerová, Rozálie ; Veverka, Václav (vedoucí práce) ; Hrabal, Richard (oponent) ; Hlouchová, Klára (oponent)
Protein-proteinové interakce se podílejí na celé řadě biologických procesů. Podrobná charakterizace jejich strukturní podstaty je důležitým nástrojem k pochopení s nimi spojených základních molekulárních mechanismů. Získané informace jsou důležité nejen pro biologii, ale také hrají důležitou roli při hledání míst vhodných pro terapeutickou intervenci. Ve strukturní biologii je nukleární magnetická rezonanční spektroskopie (NMR) spolu s rentgenovou krystalografií a jednočásticovou kryo-elektronovou mikroskopií jednou z klíčových technik s vysokým rozlišením. Její použití fyzicky limitováno velikostí studovaných molekul, ale tuto nevýhodu vynahrazuje unikátní možností pracovat s dynamickými nebo heterogenními systémy. V této disertační práci byla pro detailní strukturní charakterizaci vybraných biologicky významných proteinů a jejich komplexů využitá právě NMR poskytující důležité informace o jejich biologických rolích. Ve třech různých projektech jsem studovala (i) vztah mezi strukturními účinky konkrétních modifikací inzulínového růstového faktoru II (IGF-II) a jejich selektivitou k receptorům inzulinové osy, (ii) specifický vazebný mechanismus domény SH3 adaptorového proteinu CAS, a (iii) strukturní podstatu vazby fosfatidylinositol 4-kinázy beta (PI4KIIIβ) na buněčnou membránu. Pro strukturní...
|
|
|
Inhibitors of rhomboid proteases as tools for cell biology
Kuzmík, Ján ; Stříšovský, Kvido (vedoucí práce) ; Hlouchová, Klára (oponent)
Rhomboidní proteázy jsou intramembránové serinové proteázy. Původně byly objeveny jako proteiny důležité pro zárodečný vývoj Drosophily melanogaster, dnes je však známo, že se nachází napříč všemi skupinami organismů a jsou spojovány s řadou významných onemocnění a patogenů. Příkladem je malárie, úplavice, Parkinsonovo onemocnění, řada typů rakoviny či diabetes. Avšak u řady rhomboidních proteáz dosud neznáme jejich přirozené substráty, a tedy ani jejich funkce není často objasněna na molekulární úrovni. Vývoj jejich specifických inhibitorů je důležitý jednak pro jejich využití jako nástrojů buněčné biologie k objasnění role rhomboidních proteáz, ale také pro jejich potenciální využití ve farmakoterapii. Doposud známé inhibitory rhomboidních proteáz jsou charakteristické elektrofilním centrem, které cílí na nukleofilní serin v rámci neobvyklé serin-histidinové katalytické dyády rhomboidů. Zatím největší potenciál vykazují inhibitory v podobě peptidyl -ketoamidů s různými substituenty vázanými na dusík ketoamidové skupiny, které byly dříve vyvinuty v naší laboratoři. Jsou velmi účinné, reverzibilní, selektivní a laditelné. Jejich výhodou je také to, že využívají elektrofilní ketoamidovou skupinu, která je součástí i některých již schválených léčiv. Cílem mé práce bylo pokusit se dále zvýšit účinnost těchto...
|
|
|
Příprava receptoru AICL ve fúzi s Fc fragmentem lidského IgG
Runová, Alžbeta ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Hlouchová, Klára (oponent)
NK buňky (z angl. "natural killer cells", přirozeně zabíječské buňky) jsou jedním ze základních prvků vrozené imunity. Hrají klíčovou roli v obraně proti virem infikovaným, nádorovým nebo jinak stresovaným buňkám. NK buňky mají na svém povrchu aktivační receptory spouštějící cytotoxické mechanismy vedoucí k apoptóze cílové buňky a inhibiční receptory zajišťující buněčnou toleranci. Rovnováha signálů NK buněčných receptorů určuje výslednou reakci NK buňky s cílovou buňkou. Mezi receptory podobné lektinům typu C patří aktivační receptor NKp80 a jeho ligand AICL. AICL je myeloidně specifický aktivační receptor exprimovaný na nádorových buňkách. Komplex NKp80:AICL podporující cytolýzu maligních myeloidních buněk je studován v souvislosti s imunoterapií nádorových onemocnění. Tato bakalářská práce popisuje přípravu vektorů obsahujících geny kódující expresní kostrukty AICL a následnou produkci proteinů v linii lidských embryonálních ledvinných buněk (HEK293S GnTI- ). Expresní konstrukty obsahují část extracelulární domény AICL, zásahové místo pro TEV proteasu a Fc fragment. Byly připraveny dva různé konstrukty - jeden obsahující nativní sekvenci AICL a druhý mutaci C87S.
|
|
|
Příprava mutantů enzymu methioninsulfoxidreduktasy a jejich využití pro přípravu chirálních sulfoxidů
Havelka, Václav ; Míšek, Jiří (vedoucí práce) ; Hlouchová, Klára (oponent)
Chirální sulfoxidy jsou důležité sloučeniny ve farmaceutickém a chemickém průmyslu, nicméně jejich enantioselektivní syntéza poskytující pouze jeden žádaný enantiomer není zcela zvládnuta. Některé přirozené enzymy mohou být využity pro biokatalytickou přípravu chirálních sulfoxidů. Jedním z takových enzymů je methioninsulfoxidreduktasa. Methioninsulfoxidreduktasa je enzym omezující následky reaktivních kyslíkových radikálů v organizmu vznikajících v důsledku kyslíkového metabolismu. Její funkce je redukce methioninsulfoxidu v proteinech na methionin. Existují dva typy methioninsulfoxidreduktas, methioninsulfoxidreduktasa A redukující pouze (S)-methioninsulfoxid a methioninsulfoxidreduktasa B redukující (R)-methioninsulfoxid. Methioninsulfoxidreduktasa B je vhodná k přípravě (S)-sulfoxidů, nicméně její katalytická aktivita není dostatečná pro praktické využití. Využitím technik rekombinantní DNA a mutagenní PCR byla připravena knihovna mutantů methioninsulfoxidreduktasy B a byla určena míra a charakter zavedených mutací. Tato knihovna bude sloužit jako výchozí bod pro řízenou evoluci enzymu pro získání klonů se zvýšenou aktivitou a sníženou substrátovou specifitou.
|
|
|
Strukturní charakterizace vybraných náhodných proteinových sekvencí s vysokým obsahem neuspořádanosti
Ptáčková, Barbora ; Hlouchová, Klára (vedoucí práce) ; Šilhán, Jan (oponent)
Nepatrná část prakticky nekonečného sekvenčního prostoru dosáhla během evoluce obrovské funkční rozmanitosti proteinů. Jako nejpravděpodobnější předchůdci dnešních proteinů jsou díky konformační rozmanitosti a funkční promiskuitě považovány vnitřně neuspořádané proteiny (IDPs), které nezaujímají plně definovanou trojrozměrnou strukturu. Jak se však tyto proteiny dále vyvíjely do mnohdy rigidních a vysoce specializovaných proteinových struktur? Tato evoluční trajektorie nachází největší podporu v teorii indukovaného foldu, podle které byl vývoj struktury zprostředkován interakcí a koevolucí primordiálních nestrukturovaných proteinů s různými kofaktory či molekulami RNA. Ačkoli jsou některé náhodné sekvence z přírodou nevyužívaného sekvenčního prostoru také schopny tvořit funkční proteiny se sekundární a terciální strukturou, jako vhodnější kandidáti pro vývoj struktury a funkce se dnes zdají být náhodné sekvence s vysokým obsahem neuspořádanosti, které mají nižší tendenci k agregaci. Právě vybrané náhodné proteinové sekvence s vysokým obsahem neuspořádanosti byly v této práci strukturně charakterizovány pro jejich další využití při evolučních studiích. Na základě předchozí studie v naší laboratoři byly vybrány tři arteficiální proteiny z knihovny náhodných sekvencí. Ty byly v předkládané práci...
|
|
| |
|
|
Regulace metabolismu purinových nukleotidů jako farmakologický cíl
Brinsa, Vítězslav ; Maloy Řezáčová, Pavlína (vedoucí práce) ; Hlouchová, Klára (oponent)
Purinové nukleotidy tvoří základní stavební kameny DNA a RNA. Jsou nepostradatelnou součástí struktury některých kofaktorů, podílejí se na přenosu a skladování energie, buněčné signalizaci a regulaci biochemických procesů v buňce. Pro správnou funkci, přežití a dělení buněk je naprosto nezbytné, aby měly neustále dostatečnou zásobu nukleotidů. Hladina purinových nukleotidů je v lidském těle regulována prostřednictvím jejich metabolismu, jenž sestává ze tří koordinovaných procesů. Těmi jsou de novo syntéza, resyntéza a degradace. Regulace těchto procesů je řízena na různých buněčných úrovních od regulace genové exprese zapojených enzymů, jejich allosterické regulace až po utváření multienzymových komplexů v de novo syntéze - tzv. purinosomů. Důležitou složkou metabolismu purinových nukleotidů jsou fosforibosylpyrofosfát synthetasa I (PRS-I) a cytosolická purinová 5'-nukleotidasa (cN-II). Tyto enzymy se významně podílejí na regulaci hladiny purinů prostřednictvím jejich allostericky regulované aktivity. Poruchy aktivity těchto enzymů jsou spojeny různými onemocněními včetně dny, tvorby ledvinových kamenů, neurologických dysfunkcí či akutní lymfoblastické leukemie (ALL). Mutantní varianta cN-II nesoucí mutaci R238W způsobuje relaps ALL. Cílem experimentální části této práce byla příprava a...
|
|
|
Rekombinantní příprava jaderného antigenu proliferujících buněk (PCNA)
Herynek, Štěpán ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Hlouchová, Klára (oponent)
NK buňky (z anglického natural killer cells) jsou buňky přirozené imunity. Jejich úkolem je rozpoznávat a likvidovat nádorové nebo například viry infikované buňky. K rozpoznání takto postižených buněk slouží NK buňkám řada povrchových receptorů. Tyto receptory mohou být aktivační, které aktivují cytotoxickou odpověď NK buňky vedoucí k vyvolání apoptosy u cílové buňky, nebo inhibiční, které naopak tuto odpověď NK buněk inhibují. Zda dojde k vyvolání cytotoxické odpovědi záleží na obou typech NK receptorů. Receptor NKp44 patří do rodiny imunoglobulinových receptorů a je to jeden z aktivačních receptorů. Svými vlastnostmi je NKp44 velmi ojedinělý. Dalšími aktivačními receptory z rodiny imunoglobulinových receptorů jsou NKp46 a NKp30. V nedávné době byla popsána interakce mezi receptorem NKp44 a jaderným antigenem proliferujících buněk (PCNA) (z anglického proliferating cell nuclear antigen). PCNA je svorkový protein, který hraje klíčovou roli při replikaci a opravách DNA, neboť ukotvuje proteiny replisomu. Tato práce se zaměřuje na produkci proteinu PCNA a její optimalizaci, a na přípravu expresních vektorů pro pozdější produkci NK receptorů NKp44 a NKp46. Interakce tohoto proteinu se zmíněným receptorem bude zkoumána později. Ze stejného důvodu je připravován i expresní vektor pro protein NKp46....
|
host ::
RSS.