|
|
Mouse polyomavirus: The role of cell cytoskeleton in virus endosomal trafficking and properties of the minor capsid proteins
Žíla, Vojtěch ; Forstová, Jitka (vedoucí práce) ; Hozák, Pavel (oponent) ; Rumlová, Michaela (oponent)
Myší polyomavirus (MPyV) je neobalený tumorogení DNA virus, replikující se v jádře hostitelské buňky. Do buněk vstupuje endocytózou zprostředkovanou receptorem a jeho následný transport k jádru je závislý na kyselém prostředí endozomů a vláknech mikrotubulů, potřebných pro dopravení virionů do endoplazmatického retikula (ER). V ER dochází k disociaci virové kapsidy a rozbalení genomu viru. Mechanizmus, kterým je virový genom následně dopraven do nukleoplazmy není doposud objasněn, ale předpokládá se, že se ho kromě buněčných faktorů účastní také virové minoritní kapsidové proteiny VP2 a VP3. Po dopravení genomu do jádra dochází k produkci časných virových antigenů, které navozují vhodné prostřední pro replikaci viru. Po replikaci virové DNA a morfogenezi virionů, virové potomstvo opouští buňku během její lyze. Výzkum této disertační práce se ve své první části zaměřil na vnitrobuněčný transport MPyV a zapojení cytoskeletárních sítí během dopravy viru do ER. Zejména byl zacílen na stále nejasnou roli mikrotubulů během transportu viru v endozómech a na roli asociovaných mikrotubulárních motorů, která v případě MPyV nebyla doposud testována. Náš výzkum ukázal, že transport MPyV vedoucí k produktivní infekci nevyžaduje funkci kinesinu-1 či kinesinu-2, ale je závislý na transportu zprostředkovaném...
|
|
|
Chemically modified Murine Polyomavirus-like particles and their interaction with Prostate-Specific Membrane Antigen (PSMA)
Blažková, Kristýna ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Horníková, Lenka (oponent)
Rakovina prostaty patří mezi nejčastější nádorová onemocnění u mužů a je tedy velká poptávka po cílené léčbě. V této diplomové práci popisuji využití Glutamát karboxypeptidázy II (GCPII) jako vhodného cíle pro možné cílení. GCPII je transmembránový protein, který internalizuje po navázání ligandu, a jeho exprese v nádorech prostaty je významně zvýšená. Virům-podobné částice z myšího polyomaviru (VLPs) jsou vhodným nosičem pro vizual- izaci a léčbu. Zde popisuji modifikace VLPs inhibitory GCPII a charakterizaci jejich vazby na GCPII pomocí povrchové plasmonové rezonance a vazby na buňky exprimující GCPII pomocí konfokální mikroskopie. VLPs s inhibitory GCPII vykazují specifickou vazbu GCPII na povrchové plasmonové re- zonanci, bohužel se tato specificita ztrácí při vazbě na buňky. Jedním přístupem, jak tuto ne- specifitu odstranit, byla substituce v BC smyčce kapsidového proteinu VP1 na vnějším povrchu VLPs, která by měla být spoluodpovědná za vazbu kyseliny sialové. Tato substituce však neomezila nespecifitu částic. Dalším testovaným přístupem bylo obalení VLPs velkými poly- mery nesoucími fluorescenční značku i inhibitor GCPII. Po obalení VLPs vykazovaly tyto čás- tice v předběžných experimentech specifickou vazbu a internalizaci v buňkách exprimujících GCPII. Tyto výsledky...
|
|
|
Studium vlastností minoritních strukturních proteinů myšího polyomaviru
Bílková, Eva ; Forstová, Jitka (vedoucí práce) ; Němečková, Šárka (oponent)
Myší polyomavirus (MPyV) je jedním z modelových zástupců čeledi Polyomaviridae. Kapsida MPyV se skládá z hlavního kapsidového proteinu VP1 a minoritních proteinů VP2 a VP3. Minoritní kapsidové proteiny pravděpodobně napomáhají přesunu virového genomu přes membránu endoplasmatického retikula na cestě do jádra v časné fázi infekce. Přesný mechanismus však není znám. Pro studium interakce proteinů VP2 a VP3 MPyV s membránou byly v minulosti vytvořeny expresní plasmidy, kódující mutované VP2 nebo VP3 fúzované s EGFP. Tyto proteiny mají delece v předpokládaných hydrofobních doménách. V této práci byla sledována lokalizace mutovaných proteinů v buňkách. Ukázalo se, že pro asociaci VP2 a VP3 s membránou je nejdůležitější hydrofobní doména 2, zatímco domény 1 a 3 jsou spíše postradatelné. Studium VP2 a VP3 pokračovalo dále analýzou charakteru jejich isoforem. Byly separovány isoformy obou proteinů o různé elektroforetické mobilitě pomocí SDS-PAGE. Následná analýza hmotnostní spektrometrií ukázala, že tyto isoformy se liší v důsledku deamidace na asparaginu společném oběma proteinům (pozice 253 pro VP2 a 137 pro VP3). V minulosti byla také identifikována acetylace N-koncového alaninu VP3. Pro studium funkce nalezených modifikací byly vytvořeny mutované viry se substitucemi těchto aminokyselin. Pilotní...
|
|
|
Hlavní strukturní protein myšího polyomaviru: interakce s buněčnými strukturami
Horníková, Lenka
Myší polyomavirus (MPyV) je malý neobalený DNA virus. I když je tento virus zkoumán již více než 50 let, stále zůstává nezodpovězená otázka, jak virus dopraví svou genetickou informaci do jádra nebo jakým mechanismem jsou sestavovány viriony v infikovaných buňkách. V první části práce jsme se zaměřili na charakterizaci endocytické dráhy, kterou využívá myší polyomavirus k dopravě genetické informace do blízkosti jádra. Pomocí dominantně negativní mutanty kaveolinu 1 jsme ukázali, že internalizace a efektivní infekce MPyV není závislá na kaveolinu 1. MPyV při vstupu do buňky využívá časné endozomy. Pro produktivní infekci je nezbytné kyselé pH endozomů. Zabránění vstupu viru do časného endozomu (dominantně negativní mutanta GTPázy Rab 5) nebo zvýšení pH endozomů (chloridem amonným nebo bafilomycinem A1) vedla k drastickému snížení infektivity MPyV. Alkalizace endozomů měla za následek zadržování virionů v časných endozomech, což naznačuje, že virus je dále transportován do pozdního endozomu. Pomocí metody FRET jsme potvrdili, že MPyV je v perinukleárním prostoru lokalizován v recyklujících endozomech. Dalším, dosud málo charakterizovaným dějem životního cyklu MPyV je morfogeneze virionu. Jaderné a celobuněčné lyzáty infikovaných buněk nebo buněk transientně produkujících hlavní kapsidový protein MPyV, VP1,...
|
|
|
Příprava expresních vektorů a virových mutant pro studium minoritních strukturních proteinů polyomavirů
Cibulka, Jakub ; Forstová, Jitka (vedoucí práce) ; Šroller, Vojtěch (oponent)
Polyomaviry jsou malé neobalené DNA viry infikující ptáky a savce, včetně člověka. Jejich kapsida je tvořena hlavním kapsidovým proteinem VP1 a dvěma minoritními kapsidovými proteiny VP2 a VP3. Důležitou funkcí minoritních proteinů je pravděpodobně zprostředkování dopravy virového genomu do jádra buňky, aby mohlo dojít k úspěšné replikaci viru. Proteiny VP2 a VP3 myšího polyomaviru a viru SV40 mají schopnost vázat a perforovat buněčné membrány a má se za to, že právě tato jejich vlastnost pomáhá dopravit virový genom do jádra. V rámci této práce byly připraveny plasmidy pro produkci a vizualizaci minoritních kapsidových proteinů polyomaviru karcinomu Merkelových buněk v savčích buňkách. Tyto proteiny se svými sekvencemi výrazně liší od minoritních proteinů ostatních lidských polyomavirů i příbuzného myšího polyomaviru. Při jejich samostatné produkci v buňkách se ukázalo, že na rozdíl od proteinů VP2 a VP3 myšího polyomaviru nevykazují zřetelnou afinitu k membránám. Druhým cílem této práce byla příprava mutant myšího polyomaviru s delecemi v hydrofobních doménách proteinů VP2 a VP3, které by měly být zodpovědné za výše zmíněné membránové interakce. Tyto mutanty nebyly infekční, ale ztráta infektivity může souviset s celkovým ovlivněním produkce pozdních proteinů viru a nejen s funkcí těchto domén jako takových.
|
|
|
Vývoj experimentálního systému založeného na Cre/LoxP rekombinaci pro produkci polyomavirových mutant.
Hron, Tomáš ; Španielová, Hana (vedoucí práce) ; Šroller, Vojtěch (oponent)
Myší polyomavirus je významným zástupcem čeledi Polyomaviridae s potenciálním využitím v genové terapii a imunoterapii. Práce s virovými mutantami je důležitou součástí jeho studia, ale současné metody jejich produkce jsou pracné a poskytují nízký výtěžek. Tato práce se zabývá vývojem nového experimentálního sytému, který umožňuje pomocí Cre/loxP rekombinace generovat intaktní polyomavirový genom z rekombinantního plazmidu in vivo. Během rekombinace dochází k nevyhnutelnému vložení jednoho loxP místa do vzniknuvšího virového genomu. Byly připraveny dvě varianty produkčních plazmidů, které vytvářejí virový genom divokého typu s loxP místem vloženým mezi poly(A) signální sekvence časných a pozdních genů, nebo v intronové oblasti časných genů. Inzerce loxP místa mezi poly(A) signální sekvence měla dramatický dopad na expresi virových genů a vedla k úplné ztrátě infektivity viru. Naopak, substituce loxP místa v intronové oblasti časných genů produkci infekčního viru umožnila. Pro zajištění exprese Cre rekombinázy jsem také vytvořil stabilně transfekované buněčné linie, které mohou přípravu viru zjednodušit. Tato práce ukazuje, že nově navržený systém poskytuje uspokojivý výtěžek viru, řeší omezení vyskytující se u běžně používaných metod a může být využit pro produkci málo infekčních virových mutant. Powered by...
|
|
|
Příprava chimerických VLP myšího polyomaviru nesoucích epitopy maligního melanomu
Kojzarová, Martina ; Drda Morávková, Alena (vedoucí práce) ; Tachezy, Ruth (oponent)
Hlavní kapsidový protein virů z čeledi Polyomaviridae je schopen samovolně se uspořádat do viru podobné částice (virus-like particle, VLP), a to i bez přítomnosti minoritních proteinů, nespecificky vázat cizorodou DNA a rozpoznat receptor na povrchu buňky. Tyto vlastnosti ho předurčují k použití coby vektoru v genové terapii nebo imunoterapii. Už dříve bylo zjištěno, že VLPs myšího polyomaviru výrazně stimulují imunitní systém a mají silný adjuvantní účinek. Chimerické VLPs odvozené od myšího polyomaviru nesoucí cizorodý antigen či epitop by podle našich předpokladů po imunizaci měly vyvolat přesně cílenou odpověď imunitního systému. Hlavní překážkou je volba imunogenu dostatečně silného k vyvolání adekvátní imunitní odpovědi. Cílem této práce bylo za pomoci metod genového inženýrství zkonstruovat chimerické částice nesoucí na svém povrchu epitop maligního melanomu, který je znám jako jeden z nejimunogennějších nádorů. Pro účely budoucího výzkumu imunogenních účinků těchto částic byly zkonstruovány tři typy VLPs. Jednalo se o částice nesoucí epitopy lidského melanomu, další obsahující epitop melanomu myšího a kontrolní částice s ovalbuminovým epitopem. K účelům produkce chimerických proteinů byl použit bakulovirový expresní systém. Elektronovou mikroskopií bylo ověřeno, že vnesením nádorového...
|
|
|
Hlavní strukturní protein myšího polyomaviru: interakce s buněčnými strukturami
Horníková, Lenka ; Forstová, Jitka (vedoucí práce) ; Němečková, Šárka (oponent) ; Mělková, Zora (oponent)
Myší polyomavirus (MPyV) je malý neobalený DNA virus. I když je tento virus zkoumán již více než 50 let, stále zůstává nezodpovězená otázka, jak virus dopraví svou genetickou informaci do jádra nebo jakým mechanismem jsou sestavovány viriony v infikovaných buňkách. V první části práce jsme se zaměřili na charakterizaci endocytické dráhy, kterou využívá myší polyomavirus k dopravě genetické informace do blízkosti jádra. Pomocí dominantně negativní mutanty kaveolinu 1 jsme ukázali, že internalizace a efektivní infekce MPyV není závislá na kaveolinu 1. MPyV při vstupu do buňky využívá časné endozomy. Pro produktivní infekci je nezbytné kyselé pH endozomů. Zabránění vstupu viru do časného endozomu (dominantně negativní mutanta GTPázy Rab 5) nebo zvýšení pH endozomů (chloridem amonným nebo bafilomycinem A1) vedla k drastickému snížení infektivity MPyV. Alkalizace endozomů měla za následek zadržování virionů v časných endozomech, což naznačuje, že virus je dále transportován do pozdního endozomu. Pomocí metody FRET jsme potvrdili, že MPyV je v perinukleárním prostoru lokalizován v recyklujících endozomech. Dalším, dosud málo charakterizovaným dějem životního cyklu MPyV je morfogeneze virionu. Jaderné a celobuněčné lyzáty infikovaných buněk nebo buněk transientně produkujících hlavní kapsidový protein MPyV, VP1,...
|
|
|
Cílení umělých virových partikulí polyomaviru na buňky nádoru prostaty
Suchanová, Jiřina ; Španielová, Hana (vedoucí práce) ; Němečková, Šárka (oponent)
Cílem této práce je prozkoumat potenciál, který nabízejí umělé virové částice (virus-like particles, VLPs) odvozené od myšího polyomaviru (MPyV) jako vektory pro řízenou dopravu terapeutických a diagnostických látek do specifických buněk. Hlavní kapsidový protein myšího polyomaviru má schopnost se samovolně uspořádávat do neinfekčních VLPs. Naší snahou je přesměrovat vazbu VLPs z přirozeného receptoru na prostatické nádorové buňky pomocí změny v povrchové smyčce proteinu VP1, která je odpovědná za vazbu na receptor. Do BC smyčky VP1 proteinu jsme inzercí nebo záměnou vložili sekvenci peptidového ligandu CTITSKRTC, který se váže na prostatický specifický membránový antigen (PSMA). Tyto modifikace neměly vliv na stabilitu částic a v případě záměny došlo ke ztrátě schopnosti VP1 proteinu vázat přirozený receptor. Specifická vazba modifikovaných VLPs na PSMA byla testována metodou "pull-down assay" a technologií rezonance povrchových plazmonů. Abychom mohli dále využít tyto VLPs pro dopravu látek do buněk, testovali jsme různé způsoby jejich přípravy. Pomocí metody zabalení DNA do VLPs v přítomnosti jaderných extraktů, která napodobuje in vivo podmínky, se nám sice nepodařilo produkovat pseudokapsidy, ale úspěšně jsme optimalizovali postup pro rozložení a opětovné složení purifikovaných částic. Tento...
|
|
|
Studium minoritních kapsidových proteinů myšího polyomaviru
Vít, Ondřej ; Němečková, Šárka (oponent) ; Forstová, Jitka (vedoucí práce)
Myší polyomavirus (MPyV) je malý neobalený virus. Jeho kapsida se skládá ze 72 pentamerů hlavního kapsidového proteinu VP1. Vnitřní prohlubeň každého pentameru VP1 obsahuje jeden minoritní kapsidový protein, buď VP2 nebo VP3. Minoritní proteiny nejsou potřeba ke vzniku kapsidy, avšak pro infekci hostitelské buňky jsou nezbytné, pravděpodobně kvůli jejich předpokládaným funkcím během vstupu viru do buňky. Po vstupu do buňky jsou viriony MPyV dopraveny do endoplazmatického retikula (ER). Předpokládá se, že VP2 a VP3 jsou zodpovědné za narušení membrány ER, které je potřeba pro následné doručení virové DNA do jádra. V sekvenci VP2 a VP3 byly předpovězeny tři hydrofobní domény. První, v unikátní Nkoncové oblasti VP2, druhá a třetí ve společné části sekvence VP2 a VP3. Třetí doména je zároveň C-koncovým alfa-helixem, zodpovědným za vazbu VP1. V naší laboratoři bylo již dříve zjištěno, že VP2 a VP3 fúzované k N-konci EGFP mají při produkci v savčích buňkách obdobné VP2 a VP3 divokého typu, konkrétně afinitu k vnitrobuněčným membránám a vysokou cytotoxicitu. Aby bylo zjištěno, která z předpokládaných hydrofobních domén VP2 a VP3 je zodpovědná za afinitu k membránám a cytotoxicitu, byly připraveny expresní plazmidy, nesoucí mutované VP2 a VP3 fúzované k N-konci EGFP. Výsledky ukazují, že delece druhé hydrofobní...
|
host ::
RSS.