|
| |
|
|
Analýza genové exprese metodami sekvenace nové generace
Bláhová, Monika ; Krylov, Vladimír (vedoucí práce) ; Žárský, Vojtěch (oponent)
1 Abstrakt Cílem práce je vytvořit přehled dnes dostupných metod analýzy genové exprese, uvést výhody a nevýhody daných metod a porovnat je. Sekvenování je dnes jedna z nejpoužívanějších molekulárních metod. Sekvenovací metody se dají rozdělit na tři skupiny, sekvenování první generace, druhé generace a třetí generace. Nejvíce využívanými jsou metody sekvenování druhé generace. Avšak velký potenciál má i třetí generace, u které se ztrácí důležitost amplifikace vzorku pomocí PCR. Díky klesajícím nákladům a stoupající efektivitě se ale rapidně zvyšuje i množství dat. Rostou tak nároky na datová úložiště, výkon počítačů a důmyslnost softwarů, které velmi usnadňují zpracování získaných informací.
|
|
|
Využití environmentálního sekvenování pro studium diverzity eukaryot
Lukešová, Soňa ; Hampl, Vladimír (vedoucí práce) ; Škaloud, Pavel (oponent)
Bakalářská práce se zaměřuje na metodu environmentálního sekvenování a její využití při zkoumání diverzity eukaryotických mikrobů. Popisuje samotnou metodu, její mechanismus, možnosti použití i problémy s ní spojené. V práci je popsán současný pohled na fylogenetiku hlavních eukaryotických linií. Není opomenuta ani bližší charakteristika těchto linií. Pozornost je věnována zejména nově objeveným skupinám. Práce řeší příbuzenské vztahy uvnitř těchto skupin, shrnuje poznatky o jejich ekologii, potravních zdrojích a morfologii. Samostatná kapitola je věnována výskytu protistních skupin v extrémních podmínkách prostředí. Klíčová slova: Diverzita eukaryot, environmentální DNA, sekvenace, rRNA, fylogenetika.
|
|
|
Proteiny v těhotenství - molekulárně biologická a biochemická analýza
Muravská, Alexandra ; Kalousová, Marta (vedoucí práce) ; Černá, Marie (oponent) ; Průša, Richard (oponent)
Cílem této disertační práce bylo zavést metodiky analýzy vybraných polymorfizmů genu PAPP-A (Pregnancy-Associated Plasma Protein A) a studovat genetické pozadí genu PAPP-A a sérové koncentrace PAPP-A a PlGF (Placental Growth Factor) ve vztahu k patologickému těhotenství. Dalším cílem bylo zavést metodiku dvourozměrné (2D) elektroforézy plodové vody. Byla zavedena metoda na analýzu deseti polymorfizmů genu PAPP-A. Tyto polymorfizmy, sérové koncentrace PAPP-A a plasmatické koncentrace PlGF byly studovány u celkově 165 těhotných pacientek ve třetím trimestru gravidity s hrozícím předčasným porodem (N=98), preeklampsií (N=35), růstovou retardací plodu IUGR (N=34) a benigní těhotenskou cholestázou (N=15). 114 zdravých těhotných žen sloužilo jako kontroly. V rámci této práce byla zavedena 2D elektroforéza plodové vody. U pacientek s preeklampsií jsme nalezli signifikantně častější výskyt genotypu TT polymorfizmu Cys327Cys (C/T) genu PAPP-A v porovnání s kontrolami. Pacientky s těhotenskou cholestázou vykazovaly trend k zvýšeným hladinám PAPP-A, kdežto u pacientek s hrozícím předčasným porodem byly tyto hodnoty spíše nižší. U pacientek s těhotenskou cholestázou a hrozícím předčasným porodem se hladiny PlGF nelišily od kontrolní skupiny. Pozitivní korelace PlGF s hladinami PAPP-A byla nalezena u skupiny...
|
|
|
Detekce mutace genu VPS13B zodpovědné za syndrom uvězněných neutrofilů u vybraných plemen psů využívaných pro asistenční aktivity
Zemanová, Lucie ; Vejl, Pavel (vedoucí práce) ; Melounová, Martina (oponent)
Tato bakalářská práce na téma Detekce mutace genu VPS13B zodpovědné za syndrom uvězněných neutrofilů u vybraných plemen psů využívaných pro asistenční aktivity začíná literární rešerší dané problematiky a následně pokračuje experimentální částí, která byla provedena na katedře genetiky a šlechtění.
V literární rešerši je majoritní část zaměřena na Syndrom uvězněných neutrofilů a na Cohenův syndrom. Oba tyto syndromy jsou způsobeny mutací stejného genu a z tohoto důvodu je pes vhodným genetickým modelem pro výzkum lidského onemocnění. Z literární rešerše je jednoznačné, že Syndrom uvězněných neutrofilů je autozomálně recesivní onemocnění a je způsobeno deleční mutací 4 bází (GTTT) na 13. chromozomu v exonu 19. Tato mutace se objevuje pouze u plemene border kolie. Syndrom uvězněných neutrofilů způsobuje velmi závažné poruchy jedinců, pro které je ve většině případů toto onemocnění letální. Pokud jedinci s touto mutací přežijí první týdny života, žijí pouze velmi krátký a nekvalitní život. Trpí průjmy, horečkami, zvracením a také mají typické fretkoidní protažené tlamy.
Experimentální část je zaměřena na izolaci DNA z bukálních stěrů jedinců plemen border kolie, zlatý retrívr, labradorský retrívr a Nova Scotia duck tolling retrívr, vytvoření PCR markerů a následnou sekvenaci získaných PCR amplikonů.
Výsledky experimentální části potvrdily hypotézy, že kauzální mutace je ovlivněna plemennou příslušností a lze ji snadno identifikovat sekvenací PCR amplikonů.
|
|
|
Molekulární detekce mutace genu RYR1 způsobující maligní hypertermii u psů
Krausová, Klára ; Vejl, Pavel (vedoucí práce) ; Melounová, Martina (oponent)
Tématem této práce jsou metody molekulární detekce mutace v genomu psa, způsobující maligní hypertermii.
Práce je rozdělena na dvě hlavní části. První částí je literární rešerše shrnující poznatky o maligní hypertermii z oblasti humánní i veterinární anesteziologie, molekulární biologie a genetiky. V druhé části práce je popsána metodika a závěry vlastní molekulární detekce výše zmíněné mutace, provedené v laboratoři katedry genetiky.
Literární rešerše se zabývá syndromem maligní hypertermie. Cílem je seznámení se symptomatickými projevy, spouštěči, mechanismy, průběhem akutní maligní hypertermie a klinickou diagnostikou. V práci jsou popsány první případy pozorování syndromů maligní hypertermie a historie výzkumu, který vedl k podrobnému popsání tohoto onemocnění u člověka, psa a ostatních druhů nesoucích mutaci podmiňující maligní hypertermii.
Další částí literární rešerše je shrnutím poznatků o mechanismu mutace, detekci sekvencí obsahujících tuto mutaci a vlivu na uspořádání proteinů v ryanodinových receptorech.
V poslední části literární rešerše byly vybrány a popsány laboratorní metody, které jsou běžně využívány k neinvazivní detekci mutací akreditovanými genetickými laboratořemi. Zmíněn je i výčet laboratoří provádějících diagnostiku mutace genu RYR1 v České republice.
Experimentální bakalářské práce byla zaměřena optimalizaci molekulárního markeru umožňujícího detekci kauzální mutace RYR1 genu pomocí metody polymorfismu délky restrikčních fragmentů (PCR-RFLP). Tato metoda byla aplikována na 338 zástupců různých plemen psů. Provedená analýza nepotvrdila výskyt mutované alely v populacích hodnocených plemen. Výsledek metody PCR-RFLP byl potvrzen sekvenační analýzou.
Získané výsledky byly diskutovány s literárními zdroji, které ve většině případů nehodnotí reálná plemena, ale pracují s modelovými vyšlechtěnými liniemi s předpokládanou segregací mutované alely. Byly vysloveny závěry, že v rámci hodnocených plemen chovaných v České republice nebude představovat mutace genu RYR1 významné onemocnění. Sporadický výskyt této mutace byl konzultován rovněž s komerčními genetickými laboratořemi.
|
|
|
Analýza variability genomů Nepovirů (GFLV a ArMV) v produkčních vinicích vinařské oblasti Morava
Eichmeier, Aleš
Disertační práce byla zaměřena na studium genomů nepovirů GFLV a ArMV, zejména na studium variability těchto genomů. Dále se práce zabývá charakteristikou izolátů těchto nepovirů a charakteristikou jejich nepříliš prozkoumaných genomových částí z oblasti RNA1, konkrétně oblastí kódujících proteiny 1BHel a 1EPol. Určeným cílem této disertační práce bylo jednoznačně identifikovat rostliny révy vinné, které byly infikovány nepoviry GFLV a ArMV. Na základě navržení specifických primerových kombinací byla determinována sekvenční homologie kódujících sekvencí, a tím prokázán stupeň variability. Jedním z cílů práce bylo také standardizovat a adaptovat diagnostický systém k detekci nepovirů GFLV a ArMV v podmínkách laboratoře ústavu Mendeleum na ZF Mendelu v Lednici. Práce byla založena na hypotéze, že variabilita obou zkoumaných nepovirů je v rámci jednotlivých genomových částí nepovirů GFLV a ArMV značná. Výsledky práce byly získány zejména na základě sekvenačních analýz, provedených na jednokapilárovém automatickém sekvenátoru ABI-PRISM 310 (Applied Biosystems, Carlsbad, USA), které byly vyhodnocovány pomocí software CLC Main Workbench 5 (CLC Bio, Aarhus, Dánsko). Pomocí téhož software byl navržen real-time PCR TaqMan multiplex systém, pomocí něhož je možné detekovat a zároveň kvantifikovat nepoviry GFLV a ArMV simultánně. V práci byly sekvencovány a analyzovány genetické kódy na úrovni nukleotidů pro proteiny 2BMP, 2CCP, 1BHel a 1EPol. První z výčtu byl hodnocen zejména kvůli důležitosti pro navržení diagnostického real-time PCR TaqMan multiplex systému, v tomto případě bylo osekvencována genomová porce 290 pb 14ti izolátů GFLV a ArMV, stupeň variability byl stanoven jako sekvenční homologie v rámci nukleotidů na 71,7-97,6%. Parciální genetický kód pro 2CCP byl hodnocen v rámci 6ti izolátů GFLV a variabilita se v rámci 935 pb úseku pohybovala v rozmezí od 83% do 86% na úrovni nukleotidů a 81 až 91% na úrovni aminokyselin. Parciální genetický kód pro 1BHel byl osekvencován v rámci 6ti izolátů GFLV a variabilita kódu o velikosti 379 pb byla v rámci všech dostupných GFLV a ArMV izolátů stanovena v rámci nukleotidů 86,4-98,9% a v rámci aminokyselin 96-100%. Parciální genetický kód pro 1EPol byl hodnocen v rámci 6ti izolátů GFLV a variabilita kódu o velikosti přibližně 365 pb byla v rámci všech dostupných GFLV a ArMV izolátů stanovena na 79,5-100% a 91,4-100% na úrovni nukleotidů a na úrovni aminokyselin. Všechny získané sekvence delší než 300 pb byly uloženy do databáze GenBank/NCBI. Získané parciální kódy pro proteiny 1BHel a 1EPol kódované molekulou RNA1 jsou unikátní. Prakticky práce poskytuje výsledky, které přímo sloužily jako podklady pro vytvoření různých vektorů určených k přípravě transgenního rostlinného materiálu, který by měl vykazovat rezistenci vůči nepoviru GFLV. Dále na základě výsledků této práce byla vytvořena certifikovaná metodika popisující nově navržený real-time PCR TaqMan multiplex systém, který slouží jako účinný diagnostický nástroj k simultánní detekci nepovirů GFLV a ArMV. V neposlední řadě byl tento systém úspěšně srovnán s metodou ELISA, což by mohlo být zajímavé zejména pro diagnostické laboratoře, které se zabývají certifikací množitelského materiálu.
|
|
|
Metody pro vylepšení genomového sestavení založené na signálovém zpracování
Jugas, Robin ; Provazník, Ivo (oponent) ; Sedlář, Karel (vedoucí práce)
Diplomová práce se zabývá sekvenačními metodami a metodami sestavení genomu s využitím numerických reprezentací. Teoretická část práce popisuje historii objevu DNA, jednotlivé generace sekvenačních metod, samotné metody sestavení genomu a definici numerických reprezentací. Numerické reprezentace slouží pro převod znakové podoby DNA do numerické podoby a umožňují tak využití metod digitálního zpracování signálu. V práci je navržen algoritmus pro sestavení genomu s využitím numerické reprezentace, který je dále otestován na datech sekvencí.
|
|
| |
|
|
Identifikace a sekvenování genomu nového viru infikujícího vojtěšku
BEČKOVÁ, Martina
Samples of lucerne plants characteristic with local necrosic lesions, leave malformation and yellow spots on leaves were investigated with transmission electron microscopy. Virus particles observed there were filamentous ones of 600 to 700 nm long. Nucleic acid was isolated, transcribed and amplified using PCR. Genus-specific primers were designed based on reverse genetics from the highly conserved genes for carlaviruses, potexviruses and potyviruses. Successful amplification with carlavirus-specific primers, sequencing and comparison with sequences in GenBank database revealed presence of a carlavirus. This was later identified by nucleotide sequence comparison as a new isolate V4 of Alfalfa latent virus. Specific primers for isolate V4 were designed in a coat protein position. Half of the genom of this virus was obtained with PCR and PCR modified amplifications and compared with sequences of Alfalfa latent virus and Pea streak virus from GenBank.
|
host ::
RSS.