|
|
Dimerizace Ser/Thr proteinkinasy eukaryotního typu Streptococcus pneumoniae a charakterizace jejího substrátu, fosfoglukosaminmutasy GlmM
Pallová, Petra ; Branny, Pavel (vedoucí práce) ; Janata, Jiří (oponent) ; Španová, Alena (oponent)
104 7 Závěr 7.1 Proteinkinasa StkP Připravili jsme kmen S. pneumoniae KDTM-his, který ve svém genomu kóduje epitopem značenou kinázovou doménu proteinkinasy StkP ukotvenou do membrány pomocí transmembránové domény. Imunologickou detekcí s monoklonální protilátkou proti histidinové kotvě jsme potvrdili lokalizaci proteinu v membránové frakci S. pneumoniae. V in vitro kinázových reakcích jsme prokázali, že se jedná o plně funkční protein s autofosforylační aktivitou. Pomocí in vivo reportérového systému jsme zjistili, že transmembránová doména a extracelulární doména proteinkinasy StkP tvoří stabilní dimery. Dimerizace proteinkinasy StkP byla následně potvrzena pomocí nativní elektroforézy. Je tedy velmi pravděpodobné, že proteinkinasa StkP se in vivo vyskytuje ve formě dimeru a dimerizace je nutným předpokladem její autofosforylační aktivity. Na základě těchto výsledků jsme vyslovili hypotézu, že protein kódující kinázovou doménu postrádající transmembránovou doménu není funkční, neboť není schopen dimerizace a podléhá degradaci. 7.2 Fosfoglukosaminmutasa GlmM V in vitro kinázové reakci na bezbuněčných lyzátech S. pneumoniae Cp1015, ∆stkP a ∆phpP-stkP v přítomnosti rekombinantní proteinkinasy StkP jsme prokázali fosforylaci proteinu o molekulové hmotnosti odpovídající fosfoglukosaminmutase GlmM....
|
|
|
Bezpečnost probiotik používaných v potravinách
Balažovičová, Nikola ; Rittich, Bohuslav (oponent) ; Španová, Alena (vedoucí práce)
V teoretickej časti práce je pozornosť zameraná na definíciu probiotík, na ich zdravotné výhody, na probiotické potraviny, na kritéria bezpečnosti probiotík, vrátane metód identifikácie probiotických baktérií. V praktickej časti práce bola pozornosť zameraná na identifikáciu probiotických baktérií obsiahnutých v mliečnom výrobku Actimel. DNA v kvalite vhodnej pre PCR bola izolovaná pomocou magnetických mikročastíc P(HEMA-co-GMA). Identifikácia bola prevádzaná metódou polymerázovej reťazovej reakcie. Gélovou elektroforézou produktu sa potvrdila prítomnosť bakteriálnej DNA pre doménu Bacteria, rod Lactobacillus a druh Lactobacillus casei. Špecifické produkty PCR o veľkostiach 466 bp (doména Bacteria), 250 bp (rod Lactobacillus) a 136 bp (druh Lactobacillus casei) boli detekované po amplifikácii DNA izolovanej z probiotického mliečneho výrobku.
|
|
|
Pleiotropní efekt proteinů s WD-40 doménami na buněčnou diferenciaci a produkci sekundárních metabolitů u Streptomyces coelicolor
Ulrych, Aleš ; Branny, Pavel (vedoucí práce) ; Pátek, Miroslav (oponent) ; Španová, Alena (oponent)
Pleiotropní efekt proteinů s WD-40 doménami na buněčnou diferenciaci a produkci sekundárních metabolitů u Streptomyces coelicolor WD-40 domény, také známé jako beta-transducinové repetice, jsou vysoce konzervované aminokyselinové repetice, které se nacházejí v mnoha odlišných eukaryotních proteinech, kde plní širokou škálu funkcí. Koncem 90. let minulého století byly identifikovány první proteiny s WD-40 doménami u prokaryot, ale o jejich funkci není známo téměř nic. Streptomyces coelicolor je grampozitivní bakterie s komplikovanou buněčnou morfologií a fyziologickou diferenciací během životního cyklu. Genom Streptomyces coelicolor kóduje 6 pravděpodobných genů kódujících proteiny s WD-repetitivními motivy. Pro bližší porozumění funkce dvou z těchto WD-40 genů (wdpB a wdpC) byly připraveny jejich disrupční mutanty, u kterých byl stanoven fenotypový projev a provedena transkripční analýza. Oba mutantní kmeny vykazovaly aberantní fenotyp závislý na použitém kultivačním médiu s nejvýraznějším fenotypovým projevem mutantů na modifikovaném R3 agaru. Fenotypové studie odhalily, že delece genu wdpB způsobuje značnou redukci tvorby vzdušného mycélia a sníženou produkci undecylprodigiosinu. Kromě toho dochází u mutantaΔ wdpB k neobvyklému větvení vzdušného mycélia a k defektní sporulaci projevující se...
|
|
|
Studium funkce Ser/Thr proteinkináz a fosfatáz Pseudomonas aeruginosa
Goldová, Jana ; Branny, Pavel (vedoucí práce) ; Nešvera, Jan (oponent) ; Španová, Alena (oponent)
Reverzibilní fosforylace proteinů je považována za univerzální mechanizmus v intracelulární komunikaci všech živých organizmů. Tento proces, katalyzovaný proteinkinázami a fosfatázami, umožňuje přeložit extracelulární signály do odpovídající buněčné odpovědi a umožňuje tak adaptaci na změny podmínek v prostředí. V posledních letech byla objevena celá řada Ser/Thr proteinkináz a fosfatáz eukaryotního typu u bakterií, jejich přesná funkce a substráty však nejsou zatím příliš prostudovány. Podmíněný lidský patogen Pseudomonas aeruginosa obsahuje ve svém chromozomu minimálně 5 genů kódujících předpokládané Ser/Thr proteinkinázy a fosfatázy eukaryotního typu. V první části této práce jsme se pokusili stanovit fyziologickou roli Ser/Thr proteinkinázy PpkA a fosfatázy PppA, které jsou součástí sekrečního systému typu VI H1-T6SS. V kmeni P. aeruginosa PAO1 jsme připravili dvojitého delečního mutanta ∆pppA- ppkA. Fenotypová analýza prokázala, že v porovnání s divokým kmenem vykazuje mutantní kmen pomalejší růst v minimálním médiu a sníženou produkci pigmentu pyocyaninu. Mutant dále prokazoval významně sníženou odolnost k oxidativnímu stresu a naopak zvýšenou odolnost k hyperosmotickému stresu. V souladu s pozorovanou sníženou odolností k oxidativnímu stresu mutantní kmen hůře přežíval v baktericidním...
|
|
|
Analýza mikrobiálního složení vybraných probiotických výrobků metodou PCR-HRM
Tomanová, Barbora ; Španová, Alena (oponent) ; Trachtová, Štěpánka (vedoucí práce)
Práce byla zaměřena na průkaz probiotických bakterií ve čtyřech různých probiotických výrobcích (probiotický krém, probiotické tampóny, orální probiotikum a sójový nápoj s probiotiky). Byla ověřena viabilita bakterií obsažených ve výrobcích. Z komplexních matric výrobků byla izolována DNA v kvalitě vhodné pro metodu PCR s následnou identifikací deklarovaných bakteriálních rodů a druhů. K amplifikaci pomocí konvenční PCR a PCR v reálném čase byly použity rodově a druhově specifické primery. Ve výrobcích byly prokázány bakterie rodu Lactobacillus a Bacillus a bakteriální druhy Lactobacillus pentosus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus fermentum a Lactobacillus gasseri. Následně byla testována možnost rozlišení směsi bakteriálních druhů v DNA izolované z probiotického tampónu metodou PCR-HRM. K tomu bylo testováno pět sad primerů. Jako nejvhodnější pro rozlišení byly vyhodnoceny 2 sady primerů (primery P1V1, P2V1 a V1F-HRM, V1R-HRM).
|
|
|
Využití magnetických částic pro izolaci a purifikaci DNA
Němeček, Milan ; Španová, Alena (oponent) ; Rittich, Bohuslav (vedoucí práce)
S rozvojem molekulárně biologických metod se zvyšuje zájem o nové postupy izolace DNA o vysoké kvalitě. Izolace DNA se provádí z hrubých lyzátů buněk mnoha technikami např. fenolovou extrakcí, vysolováním nebo adsorpcí na pevnou fázi. Klasická izolace DNA, jakou je fenolová extrakce je poměrně složitá a časově náročná. Z toho důvodu byly vyvinuty nové alternativní metody izolace DNA využívající reverzní imobilizaci DNA na pevnou fázi. Velmi rozšířené je používání magnetických nosičů, které umožňují izolovat DNA ve vysoké kvalitě přímo z hrubých lyzátů buněk komplexních vzorků. Současná metoda adsorpce DNA na povrch magnetických částic neposkytuje v některých případech při analýze komplexních vzorků (např. potravin) dostatečně čistou DNA. Část inhibitorů polymerázové řetězové reakce (PCR) se zřejmě adsorbuje na stěny zkumavky, při eluci DNA dochází k jejich uvolnění do roztoku a následnému ovlivnění kvality DNA (např. snížení citlivosti amplifikace v PCR). Principem vyvíjeného postupu je konstrukce zařízení, které využívá přenos magnetických částic paramagnetickou jehlou z jedné Eppendorfovy zkumavky do druhé, ve které probíhá další zpracování vzorku. Přenosem pomocí jehly se zabraňuje přenosu kontaminujících nečistot. Navržené zařízení umožňuje realizovat výše uvedený postup. Funkčnost zařízení byla ověřena při izolaci plasmidové pUC19 DNA z hrubých lyzátů buněk E. Coli JM 109 (pUC19).
|
|
|
Identifikace mikroorganismů v kosmetických výrobcích s obsahem probiotik
Langová, Denisa ; Španová, Alena (oponent) ; Trachtová, Štěpánka (vedoucí práce)
Probiotické výrobky jsou nedílnou součástí současného trhu. Mezi výrobky obsahující přidané probiotické kultury se řadí také kosmetické výrobky. První část práce se zabývá testy na schopnost přežití bakterií v prostředí prezervačních látek, které jsou v kosmetických výrobcích obsaženy. Pro tyto testy byly použity sbírkové kmeny bakterií rodu Lactobacillus. Další část práce se zabývá izolací bakteriální DNA z probiotických kosmetických výrobků Ryor, Yoghurt of Bulgaria, FeminaMed a Lactovit Activit, a to v kvalitě vhodné pro amplifikaci v PCR. DNA byla izolována metodou fenolové extrakce a magnetickými nosiči. Přítomnost bakterií byla prokázána rodově a druhově specifickými PCR Lactobacillus. Byla provedena optimalizace druhově specifické PCR pro identifikaci Lactobacillus pentosus. Druhová identifikace byla v souladu s údaji deklarovanými výrobci.
|
|
|
Využití magnetických částic při izolaci DNA z vybraných probiotických výrobků pro děti
Vozárová, Petra ; Rittich, Bohuslav (oponent) ; Španová, Alena (vedoucí práce)
V potravinárskom priemysle je dôležité správne identifikovať druhy baktérií a ich vlastnosti, aby mohli byť použité ako probiotikum v doplnkoch stravy. Na to sa využívajú metódy DNA diagnostiky. V experimentálnej časti práce bola izolovaná DNA zo štyroch probiotických doplnkov stravy pre deti. Na izoláciu boli testované magnetické častice P(HEMA-co-GMA). Izolovaná DNA bola amplifikovaná pomocou PCR a bola preukázaná prítomnosť DNA rodov Lactobacillus, Bifidobacterium a Bacillus v súlade s údajmi deklarovanými výrobcom. Pomocou amplifikácie DNA metódou PCR s využitím druhovo špecifických primerov bola preukázaná prítomnosť druhov L.acidophilus a B.animalis v súlade s údajmi na výrobku. Pomocou PCR za daných experimentálnych podmienok nebola preukázaná prítomnosť druhu L.casei v jednom výrobku.
|
|
|
Vliv probiotické bakterie Lactobacillus paracasei subsp. paracasei na vývoj akutní kolitidy u BALB/c myší
Součková, Martina ; Jílek, Petr (vedoucí práce) ; Španová, Alena (oponent)
Zánětlivá onemocnění střeva, mezi která patří ulcerózní kolitida a Crohnova choroba, jsou chronická relapsující onemocnění nejasné etiologie. Akutní ulcerózní kolitidu jsme u BALB/c myší vyvolali podáváním 3 % dextransulfátu sodného (DSS) v pitné vodě po dobu 5 dnů. Cílem studie bylo zhodnotit vliv bakterie Lactobacillus paracasei subsp. paracasei RL14-P, která byla testována jako možné nové probiotikum, na vývoj střevního zánětu u experimentálního modelu akutní kolitidy. Laktobacily jsme myším aplikovali intragastricky 1. , 4. a 8. den pokusu a poté po dobu pěti dnů společně s podáváním DSS. Kontrolní skupiny myší dostávaly podle stejného schématu místo probiotické bakterie MRSC médium nebo fosfátový pufr. Denně jsme sledovali klinické příznaky zánětu, jako je průjem, rektální krvácení a úbytek váhy myší. Metodou ELISA jsme stanovili hladiny cytokinů (IL-6, IL-10 a TNF-α) v supernatantech po 48hodinové kultivaci slezinných buněk, buněk mezenteriálních lymfatických uzlin a střevních kousků. Histologicky jsme hodnotili stupeň poškození colon descendens. Myši prekolonizované Lactobacillus paracasei subsp. paracasei RL14-P zůstaly po dobu pokusu zdravé bez příznaků těžkého střevního zánětu. Myši, které dostávaly laktobacily, neměly zkrácené tlusté střevo, což je jeden ze znaků střevního zánětu, jak...
|
|
|
Využití magnetických mikročástic při detekci nukleových kyselin
Pešková, Aneta ; Španová, Alena (oponent) ; Rittich, Bohuslav (vedoucí práce)
Moderním a rychlým separačním postupem při izolaci nukleových kyselin v běžné laboratorní praxi je použití magnetických mikročástic. Bylo provedeno srovnání účinnosti izolace DNA z výrobků Pangamin pomocí tří typů magnetických mikročástic P(HEMA-co-GMA) (A, B), PGMA a magnetických nanočástic poly-L-lysine (PLy). Kvalita a množství izolované DNA byly ověřeny spektorfotometricky a agarózovou gelovou elektroforézou. Amplifikovatelnost izolované DNA byla ověřena pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) se specifickými primery pro kvasinky a vyhodnocena agarózovou gelovou elektroforézou. Množství izolované DNA se lišilo podle výrobku i podle typu magnetických částic. Z hlediska nejvyššího izolovaného množství DNA bylo nejvhodnější použití magnetických nanočástic poly-L-lysine (PLy) a magnetických mikročástic P(HEMA-co-GMA) (A).
|
host ::
RSS.