|
|
Transgenic RNAi in mouse oocytes
Sarnová, Lenka ; Petr, Jaroslav (oponent) ; Svoboda, Petr (vedoucí práce)
RNA interference (RNAi) is double-stranded RNA (dsRNA)-mediated mRNA degradation. RNAi has been widely used to investigate gene functions. Many methods to induce transient or stable RNAi have been developed. Transient RNAi can be induced by delivering of a long dsRNA or short interfering RNAs (siRNAs). Stable RNAi may be induced by introducing plasmids expressing a long or a short hairpin RNA. Both small and long RNAs have been used to induce transient RNAi in mouse oocytes. Nevertheless, only long hairpin-expressing system has been used to trigger stable RNAi in oocytes. Although, this system appeared to be highly efficient and specific, it has several disadvantages as complicated long inverted repeat cloning or limited possibility to test these vectors in the cell culture. Here, we constructed a short hairpin-expressing vector suitable for transgenic RNAi induction in mouse oocytes. The new vector, pTMP_ZP3_sh, was derived from a lentiviral short hairpin vector selected based on comparative study of different short hairpin-expressing plasmids. The pTMP_ZP3_sh vector was tested by targeting Moloney sarcoma oncogene (Mos) mRNA, which is a common model for RNAi in mouse oocytes. We designed several candidate short hairpin sequences and tested their efficacy. Subsequently, the most efficient one was selected...
|
|
| |
|
|
Genová exprese v průběhu expanze oocyt-kumulárních komplexů a časného embryonálního vývoje savců
Němcová, Lucie ; Kaňka, Jiří (vedoucí práce) ; Petr, Jaroslav (oponent) ; Lopatářová, Miloslava (oponent)
31 4 SHRNUTÍ Zavedla jsem real-time RT-PCT mezi základní metodiky, využívané v naší laboratoři. Během in vitro kultivace prasečích oocytů, kumulárních a granulózních buněk a in vivo expanze oocyt kumulárních komplexů byl stanoven expresní profil GDF9 mRNA, proteinu z rodiny TGFβ faktorů. Získaná parciální sekvence byla vložena do databáze EMBL/GenBank/DDBJ a gen byl lokalizován na prasečím chromozomu 2. Na rozdíl od myši byl transkript detekován poprvé též v granulózních i kumulárních buňkách rostoucích a preovulačních folikulů. Hladina GDF9 mRNA během in vitro kultivace i in vivo expanze klesala ve všech vzorcích. Popsali jsme signální dráhy, kterými insulínový růstový faktor I (IGFI) zvyšuje FSH-stimulovanou expanzi oocyt-kumulárních komplexů. Potvrdili jsme, že IGFI v kombinaci s FSH zvyšuje produkci hyaluronové kyseliny. Během kutivace kumulárních buněk s FSH došlo k postupnému snížení exprese Has2 mRNA. Avšak po 20 hodinách byla hladina stále detekovatelná v případě, kdy byl do média přidán i IGFI. Pomocí inhibitorů Akt a MAP kinázy jsme prokázali, že aktivita obou kináz je důležitá pro produkci i retenci HA. U bovinních blastocyst, připravených za rozdílných experimentálních podmínek (in vitro, in vivo v ovčím vejcovodu a v kombinaci obou způsobů) byla stanovena exprese genů pro Bax, L37 a S3a. V...
|
|
|
Vliv ubiquitinace spermií v rámci časného embryonálního vývoje u prasete
Petelák, Aleš ; Krylov, Vladimír (vedoucí práce) ; Petr, Jaroslav (oponent)
Metoda intracelulární injekce spermie je velmi efektivním nástrojem pro výzkum oplození. Po vytvoření nové laboratoře na půdě PřF UK bylo nutné nejdříve tuto metodu zavést a charakterizovat časný embryonální vývoj oplozených oocytů. Oocyty byly po oplození kultivovány do stadia blastocysty s úspěšností srovnatelnou s jinými laboratořemi (17%). Ubiquitin-proteazomální systém, který v buňce zajišťuje degradaci proteinů, se účastní regulace maturace a selekce spermií a je nezbytný pro penetraci vitelinní membrány. V těchto dějích je jeho funkce lokalizována extracelulárně. U spermií míra ubiquitinace koreluje s jejich kvalitou. Hypoteticky lze tedy předpokládat, že ubiquitinace nekvalitních spermií slouží jako negativní marker pro jejich rozpoznání a degradaci oocytárním 26S proteazomálním komplexem. Experimenty byly plánovány na základě předpokladu, že výkonnou částí selekčního mechanismu je 26S proteazom a z tohoto důvodu byl sledován vliv inhibice 20S proteazomu, pomocí peptidu MG132, na formování prvojader a následný časný embryonální vývoj po ICSI. Z pohledu zahájení dekondenzace spermie se neprojevil žádný účinek inhibice. Signifikantní rozdíl byl pozorován ve formování prvojader. U skupiny s MG132 docházelo k tvorbě prvojader jen v malém počtu případů (17%, 9%), oproti skupině bez inhibitoru...
|
|
|
Analysis of short Argonaute isoforms from mouse oocytes
Jankele, Radek ; Svoboda, Petr (vedoucí práce) ; Petr, Jaroslav (oponent)
Analýza kratkých isoforem proteinů Argonaůt z mýsích oocýtů Abstrakt: Proteiny z rodiný Argonaůtů, řízené malými molekůlami RNA, představůjí konzervované jádro mechanismů ůmlčování RNA (RNA silencing). Týto mechanismý potlačůjí prodůkci virů, šíření mobilní DNA, a regůlůjí genovoů expresi na základě sekvenční informace nesené asociovanou RNA. V somatických bůňkách savců je dominantním mechanismem regůlační microRNA (miRNA) dráha. Malé miRNA ovlivňůjí expresi většiný savčích genů. Argonaute proteiny inhibůjí translaci a indůkůjí deadenylaci mRNA s částečnoů homologií k navázané miRNA. Deadenylace obvykle výústí degradaci mRNA. Těmito mechanismý miRNA dráha citlivě kontrolůje hladiný prodůkovaných proteinů. Na rozdíl od příbůzného mechanismů RNA interference (RNAi) výůžívajícího katalyticky aktivní proteiny Argonaute schopné rozštěpit komplementárních molekuly RNA, miRNA ůmlčování je závislé na celé řadě dalších faktorů. Role miRNA regulace v komplexních biologických procesech od organogeneze, přes krvetvorbů až po rakovinu je dobře doložená. Mýší oocýtý postrádající kanonické miRNA jsoů překvapivě schopné oplození a úspěšně projdoů preimplantačním vývojem. Ani nejčetnější oocýtární miRNA však nejsou sto efektivně ůmlčet cílové gený, přestože příbůzný mechanismůs RNAi, sdílející s miRNA mechanismem klíčové...
|
|
|
Recognition of expressed double-stranded RNAs in mammalian cells
Vaškovičová, Michaela ; Svoboda, Petr (vedoucí práce) ; Petr, Jaroslav (oponent)
Dlhá dvojvláknová RNA je unikátnou štruktúrou, ktorá vzniká počas vírovej replikácie, alebo počas transkripcie repetitívnych sekvencií. Cicavčie bunky si preto vyvinuli niekoľko mechanizmov ako reagovať na dvojvláknovú RNA: interferonovú odpoveď, RNA editáciu, a RNA interferenciu. RNA interferencia je evolučne konzervovanou dráhou, ktorá vedie k sekvenčne-špecifickej degradácii cieľovej mediátorovej RNA. V cicavčích bunkách je však RNA interferencia aktívna iba v myších oocytoch, ktoré exprimujú skrátenú verziu proteínu Dicer, zatiaľ čo v somatických bunkách spúšťa dvojvláknová RNA sekvenčne-nezávislú interferonovú odpoveď. Hlavným cieľom moje diplomovej práce bolo zistiť, akým spôsobom ovplyvňujú proteíny viažuce dvojvláknovú RNA smerovanie dvojvláknovej RNA buď do dráhy RNA interferencie alebo do sekvenčne-nezávislých dráh. Na monitorovanie sekvenčne-špecifických a sekvenčne-nešpecifických efektov dvojvláknovej RNA ko-exprimovanej s proteínmi viažucimi dvojvláknovú RNA sme použili luciferázovú reportérovú esej. Naše výsledky ukazujú, že žiadny z testovaných proteínov nie je schopný stimulovať RNA interferenciu v somatických bunkách. Nadmerná expresia proteínu TRBP2 alebo proteínu PACT prekvapivo potlačuje RNA interferenciu v bunkách produkujúcich skrátenú verziu proteínu Dicer. A čo viac,...
|
|
|
Časo-prostorové utváření molekulárních gradientů v časném embryonálním vývoji Xenopus laevis.
Šídová, Monika ; Tlapáková, Tereza (vedoucí práce) ; Pěknicová, Jana (oponent) ; Petr, Jaroslav (oponent)
Detailní pochopení vývoje nového jedince zavisí na objasnění časo- prostorových mechanismů, které určují tělní plán. Z tohoto důvodu klíčovou otázkou časného embryonálního vývoje obratlovců stále zůstává, kdy a jak dochází k determinaci a diferenciaci jednotlivých buněk, což posléze vede ke specifikaci tělní osové polarity a založení základů všech orgánů a tkání. Odpověď na tuto otázku přinese nové možnosti využití nejen pro primární výzkum, ale i pro obor aplikované medicíny. Hlavní cíl předkládané disertační práce spočíval ve stanovení časo- prostorových molekulárních gradientů buněčných determinantů v průběhu časného embryonálního vývoje. Jako modelový organismus byla zvolena africká drápkatá žába, druh Xenopus laevis, která disponuje dostatečně velkými oocyty a vnější embryogenezí. Vzhledem k pozdní aktivaci embryonálního genomu se předpokládá, že stěžejní mechanismus počáteční determinace buněk závisí na nerovnoměrné lokalizaci maternálních faktorů uvnitř oocytu a jejich asymetrické distribuci do dceřiných blastomer v průběhu rýhování. Pomocí metody qPCR tomografie byly identifikovány dva hlavní lokalizační gradienty s preferencí buď v animální, nebo vegetativní hemisféře zralého oocytu. Tyto gradienty se shodovaly jak pro maternální mRNA, tak i pro miRNA molekuly. U maternální mRNA navíc...
|
|
|
Akrozomální reakce spermií u vybraných druhů savců
Frolíková, Michaela ; Stopka, Pavel (vedoucí práce) ; Jonáková, Věra (oponent) ; Petr, Jaroslav (oponent)
Savčí spermie musí před oplozením projít sérií fyziologických a biochemických změn v procesu zvaném kapacitace. Vyvrcholením kapacitace je akrozomální reakce (AR). Během AR dochází k exocytóze akrozomálního váčku do extracelulárního prostředí. Spermie, které AR neprošly, nebo se u nich dokonce akrozóm vůbec nevyvinul, nejsou oplození schopné. Výsledkem akrozomální reakce jsou dramatické změny v celé oblasti hlavičky spermie. Dochází k reorganizaci či ztrátě mnohých proteinů přítomných v plazmatické a vnější akrozomální membráně, rozsáhlým změnám v uspořádání cytoskeletu a v neposlední řadě k uvolnění intraakrozomálních proteinů do extracelulárního prostředí a odkrytí nových povrchových domén. Během kapacitace in vitro dochází u určitého druhově specifického počtu spermií ke spuštění akrozomální reakce i bez přítomností indukčního činidla v kapacitačním médiu. Tento jev je označován jako spontánní (zrychlená) akrozomální reakce. Nejnovější výzkumy ukazují, že spontánní AR je přirozenou součástí procesu oplození. Myšice rodu Apodemus vykazují vysokou mírou výskytu promiskuitního chování, a tudíž u nich existuje velké riziko výskytu kompetice spermií. U myšic se vyvinula unikátní reprodukční strategie, kdy se jejich spermie spojují do tzv. spermatických vláčků. Součástí tohoto procesu je spontánní AR,...
|
|
|
The effects of long double-stranded RNA expression in mammalian cells.
Nejepínská, Jana ; Svoboda, Petr (vedoucí práce) ; Petr, Jaroslav (oponent) ; Štefl, Richard (oponent)
Dvouvláknová RNA je cizorodá molekula, která se objevuje v buňce buď jako produkt replikace viru nebo vzniká párováním komplementárních RNA, a to v rámci jedné molekuly nebo mezi dvěma molekulami. Komplementární RNA často pocházejí z repetitivních sekvencí. U savců může dvouvláknová RNA vstupovat do jedné ze tří drah: sekvenčně specifického umlčování RNA (RNA silencing), sekvenčně nezávislé interferonové (IFN) odpovědi nebo editace pomocí adenosin deamináz. Hlavním zaměřením mého PhD projektu bylo detailně zanalyzovat efekty dvouvláknové RNA produkované v savčích buňkách, a to v rámci celého organismu. Za tímto účelem jsme vytvořili konstrukt exprimující dvouvláknovou RNA ve formě mRNA, obsahující dlouhou a perfektně párující vlásenkovitou strukturu. Transgenní myši, vytvářející dvouvláknovou RNA ve všech buňkách, byly životaschopné a, na rozdíl od výsledků dosavadních studií, neměly aktivovanou IFN odpověď. V somatických buňkách byla dvouvláknová RNA jen málo štěpena na krátké interferující RNA (siRNA), nezpůsobovala transkripční umlčování v trans a docházelo k mírné deaminaci adenosinu bez zadržování editované RNA v jádře. Shodné výsledky jsme získali v savčích buňkách, které byly tranzientně transfekovány plazmidem exprimujícím dvouvláknovou RNA. Naproti tomu ve vajíčcích způsobovala...
|
|
| |
host ::
RSS.