|
|
Vlastnosti expresních vektorů pro Corynebacterium glutamicum a jejich využití při studiu faktorů sigma RNA polymerasy
Dvořáková, Pavla ; Pátek, Miroslav (vedoucí práce) ; Konopásek, Ivo (oponent)
Cílem práce bylo charakterizovat vybrané expresní vektory pro biotechnologicky významný bakteriální druh, Corynebacterium glutamicum, a testovat možnosti jejich využití při studiu řízení aktivity promotorů faktory sigma RNA polymerasy. Měřením míry exprese modelového genu gfpuv stanovením intenzity fluorescence produkovaného proteinu a použitím analýzy populace buněk C. glutamicum exprimujících gen gfpuv pomocí průtokové cytometrie byly u studovaných vektorů zjištěny odlišné vlastnosti: míra exprese klonovaného genu, bazální hladina exprese bez induktoru, závislost míry exprese na koncentraci induktoru a stupeň homogenity buněk z hlediska exprese genu gfpuv. Pro testování biplasmidového systému pro přiřazení faktoru sigma k vybranému promotoru byl zvolen vektor pEC-XT99A, který sice neměl vysokou účinnost exprese, ale nevykazoval bazální expresi, exprese byla srovnatelná v širší škále koncentrací induktoru IPTG a buněčná populace byla z hlediska exprese modelového genu zcela homogenní. S využitím vektoru pEC-XT99A, který exprimoval jednotlivé geny pro stresové faktory sigma, byl dosud neznámému promotoru Pcg0420 jednoznačně přiřazen faktor σD , který řídil jeho funkci. Další vektor, určený pro izolaci a purifikaci proteinů z C. glutamicum, umožnil expresi genu sigM z C. glutamicum a izolaci proteinu σM...
|
|
|
Membrane interactions studied by advanced fluorescent techniques: From ions to macromolecules
Pokorná, Šárka ; Hudeček, Jiří (vedoucí práce) ; Konopásek, Ivo (oponent) ; Benda, Aleš (oponent)
Pokročilé fluorescenční techniky byly využity ke studiu tří různých projektů týkajících se biologických membrán a jejich interakcí. Následující práce je tedy rozdělena do tří samostatných kapitol, z nichž každá pojednává o jednom tématu. 1) Vliv iontů na modelové lipidové membrány byl osvětlen experimentálně metodou časově rozlišených posuvů fluorescence (TDFS, time dependent fluorescence shifts) a teoreticky pomocí molekulárně-dynamických simulací. Kombinace těchto dvou přístupů je vhodná k určení zásadních vlastností membrán jako je pohyblivost a hydratace konkrétní části membrány, uspořádání lipidové dvojvrstvy nebo vazebná místa iontů. Anionty ClO4 - , Br- , Cl- a F- , reprezentující Hofmeisterovu řadu, mají tendenci specificky interagovat s kladně nabitými molekulami lipidů v dvojvrstvě, což má vliv na uspořádání membrány. Změny pozorovaných parametrů odpovídají řazení Hofmeistrovy serie iontů. Účinky iontů jsou jak důsledkem přímé interackce iont-lipid, tak zprostředkovány nepřímo, tzn. pozměněním struktury vody v bezprostřední blízkosti molekuly iontu. Další práce, týkající se vápenatých iontů, prokázala, že Ca2+ mají afinitu jak k elektrostaticky neutrálním tak k záporně nabitým fosfolipidovým membránám, vazba iontů ovlivňuje organizaci membrány. Bylo identifikováno několik vazebných míst...
|
|
|
Studium interakce houby Pleurotus ostreatus a bakteriálních kultur na abiotickém nosiči - morfologická, biochemická a proteomická analýza
Kozická, Barbora ; Petráčková, Denisa (vedoucí práce) ; Konopásek, Ivo (oponent)
Ligninolytické houby jsou významné svými biodegradačními schopnostmi, které lze využít při odstraňování mnoha významných polutantů z životního prostředí, včetně průmyslových barviv. Jako zástupce této skupiny hub byl vybrán Pleurotus ostreatus a byla vytvořena modelová situace pro jeho průmyslové využití při dekolorizaci textilního barviva Remazol Brilliant Blue R (RBBR), které je odpadním produktem textilního průmyslu. Houba byla imobilizována na inertním nosiči (kostky polyuretanové pěny) v neprůtokovém "fixed- bed" bioreaktoru a byla simulována kontaminace houbového filtru bakteriemi, kterou lze předpokládat v praktické aplikaci při čištění odpadních vod. Jako modelová bakterie byla zvolena bakterie Rhodococcus erythropolis. Cílem této práce bylo studium vzájemných interakcí houby a bakterie v bioreaktoru při dekolorizaci barviva. Degradační schopnosti houby byly sledovány na základě produkce ligninolytických enzymů, jež se uplatňují v procesu dekolorizace. Při pozorování růstu směsné kultury houby a bakterie v bioreaktoru bylo zjištěno, že R. erythropolis v kokultuře s P. ostreatus nerostl, došlo k vymizení bakterií z kultivační tekutiny. Bylo prokázáno, že ani vysoká koncentrace houbového enzymu lakázy v médiu, změna pH média vlivem růstu P. ostreatus nebo snížení množství glukózy v médiu...
|
|
|
Pórotvorné vlastnosti toxinu CyaA bakterie Bordetella pertussis a složení membránové dvojvrstvy.
Rädisch, Robert ; Konopásek, Ivo (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Bordetella pertussis produkuje mnoho virulenčních faktorů mezi které patří adenylát- cyklázový toxin (ACT, CyaA). Tento toxin preferenčně napadá buňky imunitního systému, které mají integrinový receptor CD11b/CD18, a způsobuje tak oslabení imunitního systému hostitele. Na napadené buňky působí CyaA dvěma způsoby: 1) CyaA vytváří v membráně napadené buňky kationt-selektivní póry a způsobuje tak koloidně osmotickou lýzi napadené buňky, 2) CyaA způsobuje konverzi cytosolického ATP na signální molekulu cAMP, což způsobuje ztrátu fyziologických funkcí napadené buňky a taktéž vede k buněčné smrti. Cílem mé práce bylo otestovat vhodnost nového modelového systému ze syntetických lipidů - difytanoylů, pro charakterizaci pórotvorných vlastností adenylát-cyklázového toxinu. V minulosti se k charakterizaci využíval modelový systém z azolektinu, který je složen z mnoha různých lipidů a je tak příliš komplexní pro zjišťování úlohy jednotlivých lipidů. Dále byl zjišťován vliv cholesterolu na aktivitu adenylát-cyklázového toxinu v tomto systému, protože bylo zjištěno, že k translokaci adenylát-cyklázové domény dochází v lipidových raftech, které jsou bohaté na cholesterol. Posledním cílem mé diplomové práce bylo charakterizovat mnou nově objevený typ kanálu s dvěma vodivostními stavy. Klíčová slova: Bordetella...
|
|
|
Úloha RTX domény v aktivitě adenylátcyklázového toxinu z Bordetella pertussis
Klímová, Nela ; Bumba, Ladislav (vedoucí práce) ; Konopásek, Ivo (oponent)
Adenylátcyklázový toxin (CyaA) bakterie Bordetella pertussis je protein sestávající z 1706 aminokyselin, obsahující na svém N-konci enzymatickou adenylátcyklázovou (AC) doménu a na C-konci repetitivní RTX (z angl. Repeat-in-Toxin) doménu. Přítomnost RTX domény řadí CyaA do rodiny tzv. RTX proteinů, sekretovaných z cytosolu gramnegativních bakterií sekrečním aparátem typu I (T1SS). RTX doména CyaA se skládá z pěti bloků nonapeptidových RTX repetic s konsenzuální sekvencí X-(L/I/V)-X-G-G-X-G-X-D. Cílem této práce bylo určit úlohu RTX domény v biologické aktivitě CyaA a její vliv na sekreci toxinu z buněk Bordetella pertussis. Systematická deleční analýza bloků RTX repetic ukázala, že žádná z připravených delečních variant toxinu nebyla schopna translokovat AC doménu přes cytoplazmatickou membránu do cytosolu cílových buněk a tvořit póry v membránách těchto buněk. Odstranění jednotlivých bloků RTX repetic vedlo navíc k nízké efektivitě sekrece mutant do vnějšího prostředí bakterie. Z těchto dat vyplývá, že strukturní celistvost RTX domény CyaA hraje klíčovou úlohu nejen v cytotoxické aktivitě proteinu, ale napomáhá i při jeho sekreci přes T1SS.
|
|
|
Analýza membránových proteinů patogenní bakterie Francisella tularensis
Schmidt, Monika ; Szotáková, Barbora (vedoucí práce) ; Černý, Jan (oponent) ; Konopásek, Ivo (oponent)
Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra Katedra biochemických věd Kandidát Mgr. Monika Schmidt Školitel Doc. Ing. Barbora Szotáková, Ph.D. Název disertační práce Analýza membránových proteinů patogenní bakterie Francisella tularensis Bakterie Francisella tularensis je vysoce nakažlivý fakultativně intracelulární patogen způsobující onemocnění tularemie. Dosud jediná vyvinutá vakcína proti tomuto patogenu nemá ve většině zemí licenci pro humánní použití z důvodu nedostatečné standardizace a účinku proti vysoce virulentním kmenům. Jedním z nedávno popsaných významných faktorů virulence bakterie F. tularensis je konzervovaný hypotetický lipoprotein s homologií k thiol/disulfidoxido-reduktázám (DsbA). Odstraněním genu pro tento protein dochází k oslabení bakterie a vývoji imunoprotekce. Sekvence proteinu DsbA obsahuje C-koncovou DsbA_Com_1-like doménu, zahrnující konzervované aktivní místo C-X-X-C a cis-prolinovou smyčku, a N- koncovou peptidyl-prolyl-izomerázovou doménu FKBP typu. V této práci jsme se zaměřili na funkční a substrátovou analýzu proteinu DsbA. Funkční analýza tohoto proteinu prokázala význam jak katalytického aktivního místa a cis-prolinu, tak celé FKBP_N domény pro disulfidoxidoreduktázovou aktivitu proteinu DsbA. Dále tato práce odhalila in vitro...
|
|
|
Simulace interakce steroidních allosterických modulátorů NMDA receptorů s membránou
Riedlová, Kamila ; Konopásek, Ivo (vedoucí práce) ; Novák, Josef (oponent)
Metoda molekulové dynamiky (MD) umožňuje v reálném čase sledovat vývoj systému složeného z atomů a molekul. Takovým systémem může být např. lipidová dvojvrstva a biomolekula. MD simulace se nejčastěji uplatňuje v návrhu léčiv, kdy laboratorní experimenty s reálným objektem mohou být finančně a časově náročné nebo neproveditelné. Cílem této práce bylo objasnit využití a užitečnost metody MD aplikované na studium lipidových dvojvrstev a ukázat praktické využití této techniky, kterým je studium chování neurosteroidů v lipidových dvojvrstvách. Vhodně navržené a uměle syntetizované neurosteroidy by se mohly uplatnit v léčbě vážných neurologických onemocnění. Součástí této práce jsou i experimentální data získaná MD simulacemi pro vybrané neurosteroidy - pregnanolon glutamát a pregnanolon sulfát. Pomocí MD simulace bylo sledováno chování těchto molekul v modelových membránách a analyzováno. Klíčová slova: molekulově dynamická simulace, modelová membrána, lipidová dvojvrstva, NMDA receptor, neurosteroidy, pregnanolon glutamát, pregnanolon sulfát
|
|
|
Intracelulární život patogenní bakterie Francisella tularensis v hostiteli.
Rädisch, Robert ; Konopásek, Ivo (vedoucí práce) ; Vopálenská, Irena (oponent)
Francisella tularensis je fakultativně intracelulární patogenní bakterie, která způsobuje u hostitele onemocnění nazvané tularémie. Pro vstup do hostitelské buňky využívá Francisella hostitelské buněčné mechanismy, kterými je inkorporována do buněčného fagozomu. Z fagozomu následně uniká do cytosolu, kde probíhá bakteriální pomnožení. Některé pomnožené bakterie jsou odstraňovány autofagií, z jiných se uvolňuje dsDNA, která je rozeznána cytosolickými senzory, které vytvoří inflamazomový komplex. Inflamazom spouští dráhu vedoucí k smrti napadené buňky. Francisella již od průniku do buňky ovlivňuje buněčnou signalizaci ve svůj prospěch tak, aby si zajistila dostatečný čas a dostatek potřebných živin pro své pomnožení. Francisella nepůsobí jen v napadené buňce, kde omezuje své rozeznání a odstranění z cytosolu, ale také indukuje sekreci faktorů z buňky, které utlumí aktivaci adaptivní imunity hostitele. Klíčová slova: Francisella, tularémie, fagozom, inflamazom, autofagie, adaptivní imunita
|
|
|
Vývoj a validace metod pro detekci GMO
Hodek, Jan ; Ovesná, Jaroslava (vedoucí práce) ; Konopásek, Ivo (oponent) ; Pazlarová, Jarmila (oponent)
V předkládané práci je řešena problematika stanovení geneticky modifikovaných organismů (GMO) v rostlinách a odvozených produktech. Platná legislativa v Evropské unii nařizuje sledování GMO a upravuje pravidla pro jejich značení a dohledatelnost. Cílem práce bylo přispět k řešení vybrané problematiky kritických bodů stanovení GMO. Prvním bodem byla extrakce DNA. Problematika byla řešena pro případ extrakce DNA z plodů papáji a z kandované papáji. Pro obě potraviny byla vhodnost vybrané metody extrakce ověřena a potvrzena amplifikací specifického úseku extrahované DNA metodou PCR. Dalším bodem byla real-time PCR, kdy byla řešena problematika inhibitorů reakce. Byla ukázána inhibice real-time PCR vlivem EDTA a vlivem zbytkového množství iontů těžkých kovů, obsažených v laboratorním plastu. V obou případech vedla inhibice k ovlivnění efektivity reakce. Další kritickou částí stanovení GMO je používání screeningových elementů. Práce byla zaměřena na falešnou pozitivitu výsledků. Dalším cílem práce byl vývoj nových metod pro stanovení GMO. Byla představena metoda real-time PCR pro kvantifikaci taxon-specifického genu hrachu setého. Metoda byla ověřena na 13 kultivarech hrachu setého a vybraných příbuzných rostlinách čeledi bobovitých. Použití metody vysoce účinné kapalinové chromatografie s hmotnostním...
|
|
|
Ekologie hub, asociovaných s tlejícím dřevem v ekosystémech přirozených lesů
Zrůstová, Petra ; Baldrian, Petr (vedoucí práce) ; Konopásek, Ivo (oponent)
Tlející dřevo hraje důležitou roli v lesním ekosystému z hlediska koloběhu uhlíku a živin, regenerace lesa a uchování biodiverzity. Poskytuje prostorové niky a potravní zdroje značnému množství hub, bakterií, bezobratlých a dalším organismům. Ligninocelulóza dřeva představuje velmi odolný a obtížně rozložitelný materiál, jehož dekompozice se účastní hlavně vláknité houby. Složení houbového společenstva se mění v průběhu dekompozice, ale vztah mezi kvalitativními vlastnostmi substrátu a společenstvem dekompozitorů není zdaleka objasněn. Tato práce je zaměřena na komplexní popis houbového společenstva tlejícího dřeva vzhledem k druhu stromu, stádiu rozkladu, objemu a fyzikálně-chemickým vlastnostem dřeva jako je pH, obsah uhlíku a dusíku. Pro charakterizaci houbového společenstva byly použity sekvenační metody nové generace - 454- pyrosekvenování a sekvenování na platformě Illumina MiSeq. Druh stromu, objem dřeva (větve, kmeny) a délka tlení byly hlavními proměnnými vysvětlujícími rozdíly ve složení společenstev. Počáteční kolonizace houbami byla rychlejší u větví nežli u kmenů - svědčily o tom vyšší hodnoty enzymových aktivit a vyšší obsah houbové biomasy. Se změnou společenstva hub v průběhu dekompozice se měnily i fyzikálně-chemické vlastnosti dřeva a hodnoty enzymových aktivit. Se stoupajícím...
|
host ::
RSS.