|
|
Příprava organelových markerů v kvasinkách Saccharomyces cerevisiae
Dekha, Daniella ; Vopálenská, Irena (vedoucí práce) ; Papoušková, Klára (oponent)
Cílem práce bylo připravit sadu kmenů s fluorescenčně značenými organelami. Použitým organismem je haploidní kmen s vysokou frekvencí homologní rekombinace Saccharomyces cerevisiae BY4742. Kvasinka S. cerevisiae je jednobuněčný organizmus a patří mezi nejstudovanější experimentální živé systémy. Její generační doba bývá 1,5-2 hodiny, což umožňuje rychle sledovat vývin kultury jak na pevném, tak i v tekutém médiu. Pro každou organelu byly vybrány specifické proteiny, a to proteiny lokalizované na membráně vakuol (Vph1, Vtc3), peroxisomů (Pex3), jádra (Nvj1), endoplazmatického retikula (Sec63), mitochondrií (Cox4) a v lumen vakuol (Prc1). Vybrané proteiny byly označené připojením fluorescenčních proteinů (yEGFP, yomCherry nebo yomRuby2) k jejich C-koncům. Připravené kmeny byly analyzované v tekutých a na pevných médiích. Byly sestrojené růstové křivky, porovnána fluorescence v různých fázích růstu a zjištěn vliv dvou různých zdrojů uhlíku na expresi vybraných genů. Celkem bylo připraveno a otestováno 12 kmenů s fluorescenčními organelovými markery pro membránu vakuol, peroxisomů, jádra, endoplazmatického retikula, mitochondrií a vakuolární lumen a dále 5 kmenů s dvojicí fluorescenčních markerů pro vakuolární membránu a vybranou další organelu (membránu peroxisomů, jádra, endoplazmatického retikula,...
|
|
|
Dynamika mikrodomén plasmatické membrány kvasinek
Oláhová, Dominika ; Zahumenský, Jakub (vedoucí práce) ; Vopálenská, Irena (oponent)
Plazmatická membrána buněk se skládá ze specializovaných domén, které se liší svým tvarem, funkcí a velikostí. Toto rozdělení umožňuje buňkám koordinovat a oddělit velké množství různorodých procesů. Poruchy organizace buňky na úrovni membránových domén je stále více spojováno se vznikem patologických poruch. Svou roli mají mikrodomény též ve virulenci patogenních organismů, např. některých druhů kvasinek. Jednou z nejlépe popsaných mikrodomén plazmatické membrány kvasinek je MCC (membránový kompartment argininové permeázy Can1), jenž je stabilizován proteinovým komplexem zvaným eisosome. Složení této mikrodomény je detailně popsáno, dynamika jednotlivých komponent v bazálním stavu (tj. bez stresu) dosud popsána nebyla. Cílem této práce je podrobným přehledem dostupné literatury shrnout současné poznatky o dynamice proteinů této mikrodomény a jejím vztahu s ostatními doménami buněčných membrán. Práce zároveň prostřednictvím pokročilé fluorescenční metody FRAP (česky obnova fluorescence po fotovybělení) na vlastním experimentu ukazuje, že v bazálním stavu dochází k výměně jednotlivých molekul Nce102 v mikrodoméně MCC/eisosom. Klíčová slova: kvasinky, plazmatická membrána, membránové domény, mikroskopie, FRAP, MCC, eisosom, Sur7, Nce102
|
|
|
Faktory virulence Bordetella pertussis
Držmíšek, Jakub ; Večerek, Branislav (vedoucí práce) ; Vopálenská, Irena (oponent)
Bordetella pertussis je Gram negativní, aerobní, nesporulující kokobacil. Přestože se jedná o výhradně lidský patogen, v laboratorních podmínkách infikuje i jiné savce. Přenos mezi hostiteli je zprostředkován kapénkovou infekcí, ke které dochází bud' přímo z hostitele na hostitele nebo sekundárně z kontaminovaného prostředí. Bordetella se usazuje v horních dýchacích cestách, odkud posléze sestupuje do plic a působí onemocnění známé jako dávivý kašel, černý kašel nebo pertuse, které má ročně na svědomí přibližně 195 000 úmrtí z 16 mil. incidencí (dle zprávy WHO z roku 2010). Na základě objevu pertuzového toxinu byl černý kašel původně označován jako toxinem zprostředkované onemocnění. Postupem času byla odhalena řada dalších faktorů virulence, které lze rozdělit na adheziny, toxiny a ostatní faktory. Mezi adheziny patří filamentózní hemaglutinin, pertaktin a fimbrie, toxiny zastupuje pertuzový toxin, adenylát cyklázový toxin, tracheální cytotoxin, dermonekrotický toxin a lipopolysacharid. Většina faktorů je regulována dvoukomponentním systémem Bvg. K úspěšnému infikování hostitele je však potřeba řady dalších faktorů, jako jsou např. autotransportéry či tzv. siderophory, sloužící k získávání železa z okolního prostředí. Sekrece faktorů virulence probíhá pomocí vlastních transportních cest (autotransportéry)...
|
|
|
Úloha proteinu Erv14 v udržování homeostáze kationtů alkalických kovů v kvasince Saccharomyces cerevisiae
Hrášková, Michaela ; Papoušková, Klára (vedoucí práce) ; Vopálenská, Irena (oponent)
Protein Erv14 působí v kvasince Saccharomyces cerevisiae jako cargo receptor ve váčcích COPII. Velké množství membránových proteinů, včetně Na+, K+/H+ antiporteru plazmatické membrány Nha1, který se podílí na udržování homeostáze kationtů alkalických kovů, vyžaduje pro svůj transport z ER protein Erv14. V nepřítomnosti Erv14 je Nha1 částečně zadržován uvnitř buněk, a tím je ovlivněna i jeho celková měřitelná transportní aktivita v plazmatické membráně. Přestože Erv14 interaguje s transmembránovými doménami antiporteru, ukázalo se, že zkrácená verze antiporteru Nha1, postrádající dlouhý hydrofilní C-konec, není v transportu do plazmatické membrány na přítomnosti Erv14 závislá. Tato práce přispívá k porozumění úloze proteinu Erv14 v udržování homeostáze kationtů alkalických kovů v buňkách S. cerevisiae. Byly připraveny dva kmeny S. cerevisiae postrádající gen ERV14 a byl studován vliv této delece na růst buněk a jejich toleranci vůči solím. Dále byla pomocí heterologní exprese proteinů NHA z různých druhů kvasinek, výrazně se lišících délkou hydrofilního C-konce, studována lokalizace a funkce těchto antiporterů v buňkách S. cerevisiae za přítomnosti či nepřítomnosti proteinu Erv14. Naše výsledky naznačily, že by délka C-konce antiporterů mohla hrát roli v jejich požadavku na přítomnost Erv14 pro...
|
|
| |
|
| |
|
|
Membránový kompartment Can1 (MCC): specializovaná funkční mikrodoména plasmatické membrány kvasinek
Doudová, Lenka ; Malínský, Jan (vedoucí práce) ; Vopálenská, Irena (oponent)
Membránový kompartment Can1 (MCC): specializovaná funkční mikrodoména plasmatické membrány kvasinek Plasmatická membrána kvasinek je rozdělena na velké množství různých kompartmentů. Membránový kompartment Can1 je specifický svým proteinovým a lipidovým složením, navíc vytváří na membráně rýhovité invaginace. Za tyto invaginace jsou zodpovědné multiproteinové komplexy zvané eisosomy nacházející se na cytosolické straně MCC. Bylo zjištěno, že tato doména hraje důležitou roli v odpovědi na různé stresy. Sur7 a Nce102 jsou transmembránové proteiny MCC neznámé funkce. Sur7 v rámci MCC má spíše strukturní funkci, Nce102 má pravděpodobně úlohu v regulaci kináz asociovaných s MCC/eisosomy. Klíčová slova: biologická membrána, membránové mikrodomény, eisosom, S. cerevisiae, Sur7, Nce102
|
|
|
Struktura a funkce bakteriálních toxinů tvořících póry
Suková, Anna ; Mašín, Jiří (vedoucí práce) ; Vopálenská, Irena (oponent)
Bakteriální toxiny schopné tvorby transmembránových pórů představují širokou skupinu bakteriálních proteinů. Jsou významnými prvky virulence mnohých pathogenních bakterií. Svojí insercí do lipidové dvojvrstvy a vytvořením transmembránové póru v cytoplasmatické membráně vyvolávají narušení osmotické rovnováhy, která vede k lýzi napadené buňky. Různé skupiny toxinů využívají různé mechanismy napadení hostitelských buněk, přesto existuje několik univerzálních kroků - vazba na membránu, inserce do membrány, oligomerizace a vytvoření transmembránového póru. Klíčová slova: bakteriální toxiny tvořící póry, mechanismus inserce do membrány, cytolysiny závislé na vazbě cholesterolu, α-toxin, aerolysin, α-hemolysin, adenylát-cyklázový toxin
|
|
|
Úloha cytoplazmatické membrány a buněčné stěny v rezistenci bakterií ke kationtovým antimikrobiálním peptidům
Havlová, Noemi ; Seydlová, Gabriela (vedoucí práce) ; Vopálenská, Irena (oponent)
Kationtové antimikrobiální peptidy jsou přirozenou součástí obranných systémů všech organizmů. Vlastnosti těchto peptidů, jako je jejich struktura, náboj, amfipaticita a hydrofobicita, z nich činí slibné látky s potenciálem využití nejen v léčbě bakteriálních infekcí, ale i proti některým virům, parazitům, houbám a nádorovým buňkám. Jedním z možných zásahových míst těchto látek je cytoplazmatická membrána bakterií, kterou permeabilizují. Tento mechanizmus účinku má několikero výhod. Antimikrobiální peptidy působí selektivně na membránu bakterií a nedochází tedy k poškození eukaryotických hostitelských buněk. Další výhodou je omezená možnost vzniku rezistentních kmenů bakterií, jelikož účinky antimikrobiálních peptidů nastupují okamžitě. Ovšem i přesto byly objeveny kmeny necitlivé na již používané antimikrobiální peptidy. Pomocí modifikace zásahového místa v bakteriální buňce jsou bakterie schopny zabránit účinkům antimikrobiálních peptidů. Je-li cílovým místem cytoplazmatická membrána, bakterie může pozměnit elektrostatické nebo strukturní vlastnosti membrány a antimikrobiální peptidy ztrácejí svou schopnost interakce a následné permeabilizace membrány. Porozumění mechanizmům účinku antimikrobiálních peptidů a mechanizmům, pomocí kterých se u bakterií rezistence proti nim vytvářejí, pomůže při...
|
|
|
Intracelulární život patogenní bakterie Francisella tularensis v hostiteli.
Rädisch, Robert ; Konopásek, Ivo (vedoucí práce) ; Vopálenská, Irena (oponent)
Francisella tularensis je fakultativně intracelulární patogenní bakterie, která způsobuje u hostitele onemocnění nazvané tularémie. Pro vstup do hostitelské buňky využívá Francisella hostitelské buněčné mechanismy, kterými je inkorporována do buněčného fagozomu. Z fagozomu následně uniká do cytosolu, kde probíhá bakteriální pomnožení. Některé pomnožené bakterie jsou odstraňovány autofagií, z jiných se uvolňuje dsDNA, která je rozeznána cytosolickými senzory, které vytvoří inflamazomový komplex. Inflamazom spouští dráhu vedoucí k smrti napadené buňky. Francisella již od průniku do buňky ovlivňuje buněčnou signalizaci ve svůj prospěch tak, aby si zajistila dostatečný čas a dostatek potřebných živin pro své pomnožení. Francisella nepůsobí jen v napadené buňce, kde omezuje své rozeznání a odstranění z cytosolu, ale také indukuje sekreci faktorů z buňky, které utlumí aktivaci adaptivní imunity hostitele. Klíčová slova: Francisella, tularémie, fagozom, inflamazom, autofagie, adaptivní imunita
|
host ::
RSS.