|
|
Studium mikroRNA u pacientů se spinocelulárními karcinomy hlavy a krku
Hudcová, Kristýna ; Šulc, Miroslav (oponent)
Hledání markerů nemocí je v popředí vědeckého zájmu. Biomarker specifické nemoci by měl sloužit jako pomocník při léčbě dané nemoci - ať už pro diagnostiku onemocnění nebo pro prognózu jejího průběhu. V naší studii jsme se zaměřili na využití mikroRNA - krátkých RNA, které svým nasedáním na mRNA regulují průběh exprese jednotlivých proteinů. MiRNA jsou předmětem studia díky jejich stabilitě a funkci v regulaci mnoha buněčných procesů. V neposlední řadě mají možné uplnatění jako biomarker u mnoha onemocnění. V našem případě to jsou spinocelulární nádory hlavy a krku (HNSCC). Jelikož je tento druh nádorového onemocnění široce rozšířen a klinicky významné markery zde chybí, je naším zájmem hledat nové druhy markerů, umožňujících včasnou diagnostiku nemoci a co nejpřesnější stanovení prognózy. Vybrali jsme 3 kandidátní miRNA (miR-29c-3p, miR-200b-5p, miR-375-3p), u kterých jsme metodou qRT-PCR provedli profilaci jejich expresí ve tkáních pacientů s HNSCC. Expresi miRNA ve 42 vzorcích nádorové tkáně jsme porovnali s expresí miRNA ve tkáních přiléhajících k nádoru. Tkáň obklopující nádor je zajímavá z hlediska svých vlastností, histologicky vypadá jako tkáň zdravá, ale při bližším zkoumání tomu tak není. Je ovlivněna tkání nádorovou a může přispívat k progresi nádoru. Podařilo se nám rozlišit tyto dvě...
|
|
|
Klinicky relevantní protein-proteinové interakce v procesu bakteriální patogeneze B. pertusis
Málek, Albert ; Šulc, Miroslav (vedoucí práce) ; Černá, Věra (oponent)
Výskyt černého kašle v lidské populaci byl v průběhu 20. století díky vakcinaci silně potlačen. V posledních letech však začala inicidence černého kašle opět narůstat. Původcem této nemoci je patogenní gramnegativní bakterie Bordetella pertussis, která začíná být rezistentní vůči dosud používaným antibiotikům či vakcínám. B. pertussis napadá dýchací cesty člověka. Jedním z jejích virulentních faktorů je adenylátcyklázový toxin (ACT). Ten je sekretován z bakteriálních buněk do extracelulárního prostoru, váže se na plasmatickou membránu hostitelské buňky a translokuje do jejího cytosolu adenylátcyklázovou doménu (dAC). Tato enzymatická doména se aktivuje nekovalentní interakcí s eukaryotním kalmodulinem (CaM) a syntetizuje cAMP, jehož nadbytek má za následek apoptózu hostitelské buňky. Proteinovou interakci dAC s CaM jsme studovali pomocí metody PIXL (fotochemické zesítění, z angl. "Photo Induced Cross Linking") a hmotnostní spektrometrie (MS). Mutantní protein dAC, s inkoroporovaným foto-Methioninem (pM) na pozici Leucinu 240 (dACL240pM), jsme exprimovali v transformovaných buňkách E. coli B834 v minerálním médiu s pM. Exprimovaný protein jsme izolovali afinitní chromatografií a pomocí MS stanovili inkorporaci pM do primární struktury dAC na přibližně 50 % ve finálním preparátu. S izolovaným...
|
|
| |
|
|
Role ultrafialového záření v komunikaci u ptáků
Šulc, Michal ; Sedláček, Ondřej (vedoucí práce) ; Albrecht, Tomáš (oponent)
Poměrně nedávno bylo zjištěno, že vizuální systém ptáků a lidí se nápadně liší, a to především ve schopnosti vnímat ultrafialové záření. Tato složka spektra výrazně ovlivňuje nejrůznější typy chování ptáků. UV reflexe může vypovídat o kvalitách samců, a proto samice často preferují jedince s výraznější UV ornamentací. Stejně tak rodiče mohou potravu nerovnoměrně rozdělovat mezi svá mláďata v závislosti na jejich reflexi ultrafialového záření. Nakonec i hostitelé hnízdních parazitů mohou využívat složku UV spektra k rozpoznávání parazitických vajec od svých vlastních. Cílem mé bakalářské práce je shrnout dosavadní poznatky vlivu UV záření na pohlavní výběr ptáků, na interakce mezi rodiči a mláďaty a na interakce mezi hnízdním parazitem a jeho hostitelem.
|
|
|
Rekombinantní příprava proteinu RhoA s afinitní sondou.
Filipová, Barbora ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Šulc, Miroslav (oponent)
Počet střevních infekcí spojených s užíváním antibiotik u lidí rapidně roste. Virulentní toxiny C. difficile, Yersinií a mnoha dalších bakterií cílí na protein RhoA. Jedná se o GTPasu, která je součástí signálních buněčných drah a její hlavní funkcí je regulace aktinového cytoskeletu. Zmíněné toxiny činí tento protein nefunkčním, což může vést až k fatální destrukci buňky. V dnešní době je diagnostika popsaných infekcí nedostačující. Využití proteinových čipů a hmotnostní spektrometrie k určení modifikace proteinu RhoA se jeví jako možný způsob stanovení těchto střevních bakteriálních onemocnění. A proto je cílem této práce rekombinantně připravit kýžený protein RhoA s navázanou afinitní sondou, která bude sloužit k jeho imobilizaci na biočip. Takto připravený protein bude dále využit v diagnostice popsaných onemocnění.
|
|
|
Study of structure and interaction of human lymphocyte receptors
Bláha, Jan ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Šulc, Miroslav (oponent) ; Obšil, Tomáš (oponent)
Přirozené zabíječské (Natural killer, NK) buňky jsou důležitou složkou imunitního systému poskytující dohled nad viry infikovanými, stresem transformovanými nebo rakovinnými buňkami. Receptory NKR-P1 a jejich přirozené ligandy z genové rodiny clec2 představují alternativní "missing-self" NK buněčný systém rozpoznávání, založený na interakci vysoce příbuzných receptorů podobných C-lektinům. Lidské NKR-P1 bylo objeveno před vice než dvaceti lety, přesto stále zůstává jediným lidským orthologem této receptorové rodiny početné především u hlodavců. Po navázání na svůj přirozený ligand LLT1 receptor NKR-P1 může předávat inhibiční nebo kostimulační signály. Pro svou potenciální roli v imunitním úniku nádorů a autoimunitě jsou zajímavými cíli výzkumu, přesto je povaha jejich interakce stále nejasná. Abychom objasnili strukturní povahu jejich interakce, vyvinuli jsme obecně použitelnou metodu pro rekombinantní expresi lidského NKR-P1 a LLT1 a jejich homologů založenou na transfekci buněčné linie HEK293S GnTI- . Popsali jsme stabilizující mutaci His176Cys umožňující přípravu vysoce stabilního rozpustného receptoru LLT1. Připravený receptor LLT1 a lidské NKR-P1 jsme vykrystalizovali v různých glykosylačních stavech jednak samostatně a také v jejich komplexu. Struktury LLT1 i NKR-P1 obsahují klasické...
|
|
|
The novel combinations of experimental approaches: mass spectrometry (MS) and photo-induced surface labelling, electron release (PIER), or cross-linking (PIXL)
Tuzhilkin, Roman ; Šulc, Miroslav (vedoucí práce) ; Kavan, Daniel (oponent)
V živých organismech probíhá každým okamžikem nespočet dějů s účastí přenosu/transportu elektronu (ET). Proto jejich studium je důležitým cílem moderní strukturně-funkční proteomiky. Pro řadu experimentů byl a je používán modelový protein azurin z P. aeruginosa. Tento modrý protein obsahující centrální atom mědi má charakteristické absorpční maximum při 630 nm v redoxním stavu Cu(II). Během jeho oxidace na Cu(I) dochází k poklesu hodnoty absorbance při 630 nm (A630) a tak lze UV-Vis spektra použít pro sledování průběhu jeho ET reakcí. Naším cílem bylo vložit světlem aktivovatelný strukturní analog kanonické aminokyseliny Met - L-2-amino-5,5-azihexanovou kyselinu (foto-Met) - do sekvence azurinu a využít vzniklý proteinový produkt pro studium oligomerizace azurinu v roztoku pomocí techniky světlem iniciovaného síťování (PIXL). Použitím optimalizovaných protokolů pro rekombinantní expresi v E. coli B834 jsme vložili foto-Met do přirozeného azurinu a konstruktu Az2W, ve kterém jsou přítomny dva blízké Trp, u kterých byla potvrzena role při elektronovém přeskoku ("hopping") napříč protein-proteinovým rozhraním. Míra inkorporace foto-Met do sekvence proteinů byla určena pomocí MALDI-TOF MS po separaci proteinů na SDS-PAGE a štěpení proteasou v gelu. Pomocí metody PIXL byl studován vliv rostoucí celkové...
|
|
|
Evoluce a funkce polymorfismu u výstražně zbarvené kořisti
Fárová, Monika ; Exnerová, Alice (vedoucí práce) ; Šulc, Michal (oponent)
Polymorfismus u výstražně zbarvené kořisti lze předpokládat, pokud není tato kořist chráněná před predací žádným jiným způsobem než svým zbarvením. Oproti tomu u chráněné kořisti byl polymorfismus ještě donedávna záhadný fenomén kvůli své delšímu a nákladnějšímu averznímu učení predátorů. Jednotlivé morfy se mohou lišit různými parametry zbarvení: barvou, vzorem, mírou melanizace a vnitřním a vnějším kontrastem zbarvení. To znesnadňuje predátorovi zapamatovat si chráněnou kořist a napříště se jí vyhnout. Selekční tlaky a mechanismy ze strany predátorů vedoucí ke vzniku polymorfismu se u chráněné a nechráněné kořisti liší. U nechráněné kořisti je to negativně frekvenčně závislá selekce podporující vzácné morfy nebo hypotéza více modelů pro jeden mimetický druh. U chráněné kořisti se polymorfismus může objevit na dočasnou dobu (tedy být nestálý), dále je umožněný prostorovou heterogenitou morf nebo, stejně jako u nechráněné kořisti, může mimetik napodobovat více modelů. Také by se na existenci polymorfismu mohla podílet quasi-batesovská mimeze, a to vlivem podobných mechanismů, jako u nechráněné kořisti. Kromě selekce ze strany predátorů se na existenci polymorfismu ve varovné signalizaci kořisti podílí i další faktory jako termoregulace, pohlavní výběr a střet více typů selekce, které mohou být...
|
|
|
The preparation and characterisation of analogues of insulin and IGF-2 selective for both isoform of insulin receptor and IGF-1 receptor
Mlčochová, Květoslava ; Žáková, Lenka (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent) ; Šulc, Miroslav (oponent)
Insulin a insulinu podobné růstové faktory 1 (IGF 2) jsou příbuzné proteinové rozdílnými, avšak překrývajícími se biologickými funkcemi. Všechny tři hormony interagují, i když s různou afinitou, s receptory, patřící do systému insulinu IGF (insulinové 1R)). Právě rozdílná schopnost interakce s jednotlivými receptory je jeden z hlavních nástrojů regulace tohoto systému, který je nezbytný pro správné fungování organismu. Ačkoli aminokyseliny, které se přímo účastní interakce s receptory, se nacházejí zejména doménách A a B, domény C a D mají patrně určitou úlohu ve vazebné specificitě. V rámci tohoto projektu jsme se nejprve zaměřili na vliv domén D z domény C z ). Abychom mohli sledovat vliv domén C a D, připravili jsme insulinové celými nebo částmi jednotlivých domén tak, aby uspořádání odpovídalo přirozené IGF. U takto připravených analogů byly studovány vazebné afinity a jejich Výsledky odhalily, že úvodní část domény D má ničivý účinek na afinitu k IR. Tento účinek je pouze mírně zvýrazněn přítomností zbytku domény (D ). Doména D nemá téměř žádný účinek na afinitu k . Dále bylo zjištěno, že přidání aminokyselin odvozených z domény konec řetězce B vede ke zvýšení afinity a schopnosti aktivovat IR B. Toto nečekané zjištění otevírá nové možnosti zvýšení specificity vůči isoformě B IR. Abychom byli schopni...
|
|
|
Příprava DNA-vazebné domény Forkhead transkripčního faktoru FOXO3
Dolejš, Vojtěch ; Šulc, Miroslav (vedoucí práce) ; Ptáček, Jakub (oponent)
Tato bakalářská práce je součástí projektu, jehož cílem je vývoj nízkomolekulárních látek schopných inhibovat interakci lidského transkripčního faktoru FOXO3 s DNA. Hlavním cílem této bakalářské práce je příprava 15 N značené DNA-vazebné domény proteinu FOXO3 (FOXO3-DBD) a ověření její nativní struktury pomocí 1 H-15 N HSQC NMR experimentu. Transkripční faktory FOXO jsou důležité a evolučně konzervované regulační proteiny, které se účastní mnoha důležitých buněčných dějů. Aktivita FOXO proteinů je regulována posttranslačními úpravami, z nichž nejdůležitější jsou fosforylace, acetylace a ubikvitinace. Forkhead transkripční faktory zastávají značný počet různých buněčných funkcí, ovšem jejich exprese může probíhat pouze v některých typech tkání. Obsahují asi 100 aminokyselin dlouhou DNA-vazebnou doménu složenou z několika částí. Mezi jejich funkce patří regulace buněčného cyklu a apoptózy, proliferace a diferenciace buněk, kontrola metabolismu a regulace protistresové odpovědi. U některých typů nádorových buněk je resistence vůči chemoterapii zprostředkována právě vysokou aktivitou transkripčního faktoru FOXO3. Z tohoto důvodu je nutné hledat způsoby, jak cíleně potlačit funkci tohoto proteinu. Klíčová slova FOXO3, exprese, purifikace, NMR
|
host ::
RSS.