|
|
Utilisation of fluorescence techniques for analysis of industrially relevant microorganisms
Müllerová, Lucie ; Kráčmar, Stanislav (oponent) ; Krčma, František (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Single-cell analysis techniques are very important when studying relevant biotechnological microorganisms. In biotechnological processes, the optimum is to have fast, efficient and real-time analyses that can be done with minimal preparations. Therefore, we looked at autofluorescence as a possible and natural marker when employing fluorescence microscopy and flow cytometry. First, it has been established, based on the emission spectra, that the green autofluorescence of the bacteria used – Cupriavidus necator H16 and its non polyhydroxyalkanoates (PHA) producing mutant Cupriavidus necator PHB-4, is caused predominantly by flavins. The maxima of emission spectra were 510 – 550 nm for FAD, FMN and riboflavin whose spectra could not be distinguished, and 515 nm for both strains of Cupriavidus necator. Two maxima of excitation spectra of the bacteria were found – one in the range 360 – 370 nm and another around 440 nm, and so a new protocol for fluorescence microscopy has been established - the laser used was 467 nm and the emission filter chosen for the detection was 520/35 nm. Flavins and their autofluorescence can also be used in combination with other fluorophores when the need for multi-parametrical analyses arises, but it’s highly recommended the other dyes emit other than green fluorescence in the band of 500 – 550 nm or/and have an average fluorescence lifetime other than 3.2 – 3.7 and 4.2 - 4.9 ns. These values stayed constant even when the cells were exposed to various cultivation and even stress conditions. That makes them a very stable marker compared to the dynamic marker of fluorescence intensity that changes immediately after a change in the environment. A new staining protocol for C. necator using PHA-specific hydrophobic probe BODIPY 493/503 was optimised. The optimal staining concentration of the lipophilic dye BODIPY 493/503 was determined to be 2.5 µg ml-1 and it can be used in combination with propidium iodide. The BODIPY 493/503 staining protocol has been used when analysing the morphology of the PHA-synthesising bacteria Halomonas halophila. Further, to study the UV-protective properties of PHA in Cupriavidus necator, another staining essay has been optimised. It has been established that the ROS sensitive dye CM-H2DCFDA gives better performance than its non-methylated form. Also, the UV-protective characteristics of the PHA-synthesising strain Cupriavidus necator H16 were confirmed when compared to its non-PHA synthesising strain C. necator PHB-4.
|
|
|
Využití hlemýžďovitých v testech ekotoxicity
Fojt, Pavel ; Komendová, Renata (oponent) ; Kráčmar, Stanislav (oponent) ; Zlámalová Gargošová, Helena (vedoucí práce)
Tématem této dizertační práce jsou možnosti využití hlemýžďovitých v testech ekotoxicity. Konkrétně využití kosmopolitního terestrického plže druhu Helix aspersa aspersa (syn. Cantareus aspersus nebo Cornu aspersum). Životní cyklus těchto plžů probíhá ve velmi těsném kontaktu s půdním ekosystémem. Zde se také zúčastňuje některých velmi důležitých procesů, jako je především dekompozice odumřelé organické hmoty. Práce bude soustředěna na vyžití těchto plžů při hodnocení ekotoxicity vybraných elementů, které mohou v různé míře vstupovat do půdního prostředí. Především se bude jednat o hodnocení vlivu těžkých kovů. Dalším aspektem bude také rozdělení ekotoxikologických testů do různých kategorií v závislosti na životním stádiu tohoto organismu a následně srovnání citlivosti daných stádií ke konkrétní úrovni kontaminace určitými polutanty.
|
|
|
VÝVOJ A TESTOVÁNÍ PŘÍRODNÍCH SLOŽEK POTRAVIN PRO DĚTSKOU VÝŽIVU
Hoová, Julie ; Kráčmar, Stanislav (oponent) ; Vítová, Eva (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
Předložená disertační práce se zabývá vývojem a testováním přírodních složek potravin pro dětskou výživu. V rámci práce byly vybrány skupiny rostlinných potravin, které byly zkoumány z nutričního hlediska, a také na obsah biologicky významných látek, zejména látek s antioxidačním a antimikrobiálním účinkem. Z hlavních nutrientů byl sledován celkový obsah sacharidů, redukující cukry, nerozpustná vláknina, zastoupení celkového dusíku a profil mastných kyselin. Ve vybraných vzorcích byl poté sledován obsah vitaminů a provitaminů, celkových fenolických látek, flavonoidů, antioxidační kapacita, přírodní barviva, množství fruktanů a -glukanů, organické kyseliny. Za účelem vyhodnocení antimikrobiálního účinku byla sledována interakce materiálů s příslušnými zástupci buněk. Bezpečnost přípravků byla hodnocena pomocí testů cytotoxicity na humánních buněčných liniích HaCaT a Caco-2. Za účelem zvýšení stability a maskování nevhodných senzorických vjemů byla zařazena enkapsulace vybraných extraktů do nanočástic, zejména liposomů o různém složení. U těchto částic byla sledována distribuce velikosti, uniformita, zeta potenciál, enkapsulační účinnost a postupné uvolňování aktivních složek. Slunečnicový a sójový lecithin byl vyhodnocen jako nejvhodnější pro přípravu liposomů. V další části práce byly kultivovány vybrané kmeny probiotických bakterií, u kterých byl sledován vliv použitých technik enkapsulace na jejich viabilitu. Poté byl sledován vliv přítomnosti některých látek rostlinného původu na probiotickou viabilitu, a to i v podmínkách modelového trávení. V rámci stanovení viability byly využity techniky kultivační, ale i průtoková cytometrie. Na základě získaných výsledků byly vybrány extrakty rostlinného původu bohaté na množství biologicky významných látek s pozitivním vlivem na lidský organismus i na metabolismus probiotických bakterií. Vhodnou kombinací se v této práci jevil zejména mladý ječmen s vybranými zástupci laktobacilů a bifidobakterií. V poslední fázi práce byl zkoumán přechod spécií biogenního prvku selenu, jakožto zástupce přirozených antioxidantů v těle, a to z matky na dítě prostřednictvím raného mateřského mléka – kolostra. V práci byla potvrzena důležitá role kolostra ve výživě novorozenců. V kolostru byla zjištěna přítomnost selenoproteinu P, který je jakožto primární antioxidant přijímán dítětem bezprostředně po narození a přispívá k jeho obranyschopnosti. Celkově lze konstatovat, že i přes nesporný zásadní význam bílkovin pro dětskou výživu představují další biologicky aktivní látky rostlinného původu, případně kombinace probiotik a prebiotik, velký přínos a přispívají ke zvýšení nutriční hodnoty a kvality potravin určených pro dětskou výživu. KLÍČOVÁ SLOVA: selenometabolity, antioxidanty, doplněk stravy, dětská výživa
|
|
|
Use of some molecular techniques to metabolic characterization of industrially significant yeasts
Kostovová, Iveta ; Brázda, Václav (oponent) ; Kráčmar, Stanislav (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
Carotenoids, ergosterol and fatty acids are valuable compounds used in food, feed and cosmetic industries. Since their conventional sources depend on weather conditions, season, geographical location, and availability of agricultural land, it is necessary to increase its availability for constantly increasing demand. Microbial production of aforementioned compounds exploiting carotenogenic yeast is promising due to their extraordinary capability to simultaneously produce carotenoids, ergosterol and fatty acids. Hereby Doctoral Thesis was aimed to provide the molecular and metabolic characterisation of various carotenogenic yeasts and their potential for industrial applications. For this purpose, the first experimental parts are focused in great detail on yeast species R. mucilaginosa and R. toruloides, their production properties and the influence of nutritional stress and different carbon sources, such as xylose and glycerol. Besides the detailed characterization of their production properties, were these strains also characterized by molecular methods, including sequence analysis of ITS1, ITS2 and D1/2 of the ribosomal operon and analysis of mini and microsatellite sequences M13 and GTG5. R. toruloides is known as an excellent producer of fatty acids and because of it, it recently became a target carotenogenic yeast for the development of tools for its genetic manipulation. In this work were successfully prepared genetically modified clones of R.toruloides bearing over-expressed genes for DGA1 (diacylglycerol acyltransferase) and GPD1 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase). Their production of fatty acids was not higher in comparison to the original strain. Therefore, the next part was focused on the preparation of overproducing mutant strains prepared by random mutagenesis. The combination of nitrogen limitation and the carotenoid production inhibitor diphenylamine led to the successful selection of carotenoid overproducing robust mutant strains with resistance to diphenylamine. The last part of the thesis deals with the production properties of lesser known carotenogenic yeast species among order Sporidiobolales and Cystofilobasidales in comparison to relatively well studied carotenogeic yeast species represented by R. toruloides and P. rhodozyma. The best fatty acid-producing strains were S. metaroseus CCY19-6-20 and C. macerans CCY 10-01-02. Moreover, the best carotenoid producer, R.mucilaginosa CCY 19-04-06, naturally produced lycopene in amounts representing more than 80 % of total carotenoids.
|
|
|
PŘÍPRAVA A CHARAKTERIZACE NANOČÁSTIC A NANOVLÁKEN NA BÁZI BIOPOLYMERŮ A JEJICH VYUŽITÍ V POTRAVINÁŘSTVÍ A KOSMETICE
Kundrát, Vojtěch ; Vilčáková, Jarmila (oponent) ; Kráčmar, Stanislav (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
Předložená disertační práce se zabývá polymerem polyhydroxybutyrátem a dalšími biopolymery jakožto základním stavebním kamenem pro výstavbu mikro a nanoskopických struktur a materiálů použitelných v potravinářství a kosmetice. V rámci práce byla vypracována literární rešerše seznamující čtenáře se základy tohoto aplikačního pole. Experimentální část práce je sestavena ze tří bloků výsledků získaných během doktorského studia. V prvním, hlavním bloku jsou uvedeny komentované publikované výsledky a patentové výstupy, které zahrnují dva publikované recenzované články zabývající se elektrostatickým a mokrým zvlákněním PHB a vlastnostmi připravených materiálů. Patentové výstupy jsou tvořeny několika přijatými a podanými patenty, které shrnují několikaletou práci jednak na metodách zvláknění PHB, ale taktéž na obecných přístupech umožňující zpracovávat PHB v podobě roztoku do podob umožňujících mnohé aplikace v potravinářství a kosmetice. Druhá část je tvořena jedním z praktických výstupů, jímž je patentovaná kompozice ochranného krému proti UV záření založena na připravených nanoskopických a mikroskopických morfologiích PHB. Ve třetím bloku jsou shrnuty další výsledky zaměřené na elektrostatické zvláknění PHB a dalších biopolymerů. V závěru práce je uveden stručný popis projektů souvisejících s tématem disertační práce. Jde o praktické rozvojové práce ve střední Tanzánii a západní Africe, které ale čerpají z vědomostí a kontaktů nabytých během studia na FCH VUT Brno.
|
|
|
Faktory ovlivňující senzorickou jakost analogů tavených sýrů
Sůkalová, Kateřina ; Kráčmar, Stanislav (oponent) ; Diviš, Pavel (oponent) ; Buňka,, František (vedoucí práce)
Předložená dizertační práce se zabývá sledováním senzorické kvality tavených sýrových analogů, se zaměřením především na chutnost (flavour) a s ní související obsah těkavých (aromaticky aktivních) látek. Modelové vzorky analogů byly vyrobeny standardním postupem pro výrobu tavených sýrů na Univerzitě Tomáše Bati ve Zlíně. Experimentální část byla rozdělena do dvou experimentů, které se lišily složením modelových vzorků analogů. V prvním experimentu byl tradiční tuk (máslo) zcela nahrazen vybranými rostlinnými tuky (palmový, kokosový, směsný), ve druhém experimentu byla nahrazena pouze část (1 % hm. - vyjádřeno na celkovou hmotu vzorku) másla rostlinnými oleji (meruňkový, lněný, rybízový, hroznový). Pro stanovení těkavých látek byla použita mikroextrakce tuhou fází ve spojení s plynovou chromatografií s plameno-ionizační detekcí. Pro hodnocení senzorické kvality vzorků, se zaměřením především na flavour, byly použity metody vycházející z platných mezinárodních norem, konkrétně hodnocení pomocí stupnic (ČSN ISO 4121), profilový test (ČSN EN ISO 13299) a pořadová zkouška (ČSN ISO 8587). Podstatou práce bylo posouzení vlivu přídavku různých rostlinných tuků/olejů na uvedené parametry, zároveň byly sledovány jejich změny v průběhu 6 měsíčního skladování (při 6 °C). Výsledky prokázaly, že použitý rostlinný olej ovlivňuje jak senzorickou kvalitu, tak i obsah a složení těkavých látek vyrobených analogů. Výrazné rozdíly mezi vzorky byly především v chuti, vůni a celkové přijatelnosti. Zhoršující se celkovou přijatelnost vzorků lze v experimentu I vyjádřit pořadím: výrobek s máslem kokosovým palmovým směsným tukem; v případě experimentu II: výrobek s máslem meruňkovým = lněným = hroznovým rybízovým olejem. Jako nevhodné se pro výrobu analogů ukázaly být směsný tuk, rybízový a hroznový olej, naopak nejlépe byly hodnoceny analog s kokosovým tukem a meruňkovým olejem. Na základě výsledků senzorické analýzy bylo prokázáno, že vzorky si udrží dobrou senzorickou kvalitu min. po dobu 3 měsíců při dodržení nízké skladovací teploty ( 6 °C). Analog s kokosovým tukem, jehož chuť, vůně a přijatelnost byly hodnoceny jako velmi dobré, a s meruňkovým olejem, jehož chuť, vůně a přijatelnost byly hodnoceny dokonce jako výborné, by mohly obohatit nabídku potravin na trhu.
|
|
|
Controlled production of lipids and lipidic substances by selected yeasts and microalgae
Szotkowski, Martin ; Kráčmar, Stanislav (oponent) ; Huelva, Ines Garbayo Nores, University (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
Carotenoids are natural pigments found in microorganisms such as algae, yeast and cyanobacteria. They represent the most widespread group of antioxidants with a significant biological effect. Currently, there is a growing interest in carotenoids due to their beneficial effects on human health. Chlorophylls are green photosynthetic pigments that are used in the food industry as intensive green dyes. Coenzyme Q is known for its positive effect on the proper functioning of a number of organs in the human body. Ergosterol is an integral part of the membranes of yeasts and fungi. It is a provitamin D2, which is an important part of the immune system. Microbial lipids, or ‚Single cell oils’, are characterised by a high content of healthy unsaturated fatty acids that can be used in pharmacy or cosmetics. Microbial lipids are further studied as an alternative for the production of biofuels. The dissertation focused on the study and possibilities of optimising the production of lipids and lipid substances by selected strains of carotenogenic yeasts, microalgae and cyanobacteria. The tested yeasts of the genera Rhodotorula, Rhodosporidium, Cystofilobasidium and Sporidiobolus were cultivated on a series of different media with different C/N ratios in the range of 13 to 100, containing processed waste substrates of the food industry. Selected strains were then cultivated in bioreactors with medium containing a combination of waste substrates. Cultures of microalgae of the genera Desmodesmus, Scenedesmus, Chlorella, Coccomyxa, Chlamydomonas, Botryococcus dealt with the optimisation of individual components of the medium and the application of various stresses in order to increase the production of the studied metabolites. Pilot large-volume cultures in open tanks were performed as part of experiments with the extremophilic microalgae Cocomyxa. In the final part, pilot screenings and large-volume bioreactor experiments focused on the possibilities of co-cultivation of carotenogenic yeasts and microalgae were performed. The tested yeast strains were able to utilise media containing hydrolysed waste substrates with varying success. The best strain was Sporidiobolus pararoseus, which achieved the highest biomass production and studied metabolites in the media. The tested waste substrates were a combination of waste frying oil and coffee grounds hydrolysate. Successful optimisation of the composition of the mineral medium's main components led to increased production of the studied metabolites. The most important effect exhibited particular P/N ratio and the application of oxidative stress. Desmodesmus and Scenedesmus microalgae achieved the best results. Large-scale cultures of Coccomyxa onubensis confirmed the resistance of the culture to contamination by external influences and the ability to grow at high temperatures and light intensities. Co-cultivation experiments confirmed the ability of symbiotic growth of yeasts and microalgae. The best results were obtained in all tested yeasts co-cultivated with microalgae of the genus Desmodesmus and Scenedesmus and, to a lesser extent, with the genus Coccomyxa.
|
|
|
PRODUCTION OF BETA-GLUCANS AND OTHER POLYSACCHARIDES BY YEAST AND MICROALGAE
Byrtusová, Dana ; Kráčmar, Stanislav (oponent) ; Kovalčík, Adriána (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
Beta ()–glucans are polysaccharides composed of D-glucose monomers. Nowadays, -glucans are gaining attention due to their attractive immunomodulatory biological activities, which can be utilized in pharmaceutical or food supplementation industries. Nowadays, the only biotechnological yeast source is Saccharomyces cerevisiae. However, some carotenogenic Basidiomycetes yeasts, previously explored for lipid and carotenoids co-production, could potentially co-produce a significant amount of –glucan. In the present Doctoral Thesis, the culture conditions were optimized for the production of -glucans and other microbial polysaccharides at carotenogenic yeast and microalgae. The genera of Rhodotorula, Sporobolomyces, Cystofilobasidium, and Dioshegia were tested. From non-carotenogenic yeast, the Metschnikowia genera and some ascomycetes yeast were selected together with some green and red algal strains. The experimental part is focused also on the possibility of co-production of other metabolites, like lipids, pigments, and extracellular polymers. In the first part of the experiment, the effect of four C/N ratios (10:1, 40:1, 70:1 and 100:1) on the production of biomass, -glucans, carotenoids, and lipids was evaluated et yeast strains. From all strains, the S. cerevisiae CCY 21-4-102, C. infirmominiatum CCY 17-18-4, P. rhodozyma CCY 77-1-1 and R. kratochvilovae CCY 20-2-26 exhibited the highest -glucans production and were chosen for next analysis, mainly salt stress, temperature, and nitrogen sources in the culture medium. Additionally, R. kratochvilovae CCY 20-2-26 produces extracellular glycolipids and S. pararoseus CCY 19-9-6 extracellular polysaccharides. Next, the diversity of -glucan content among the other twelve Saccharomyces strains and polysaccharides production at microalgae was assessed.
|
|
|
Recent results on the problem of motion of viscous fluid around a rotating rigid body
Deuring, P. ; Kračmar, Stanislav ; Nečasová, Šárka
We consider the linearized incompressible flow around rotating and translating body in the exterior domain R³D‾, where D⊂R³ is open and bounded, with Lipschitz boundary. We derive the pointwise estimates for the pressure. Further, we consider the linearized problem in a truncation domain DR:=BRD‾ of the exterior domain R³D‾ under certain artificial boundary conditions on the truncating boundary ∂BR, and then compare this solution with the solution in the exterior domain R³D‾ to get the truncation error estimate.
|
|
|
Studium metabolismu bakteriálních buněk a vlivu stresu na biosyntézu PHA
Kučera, Dan ; Kráčmar, Stanislav (oponent) ; Ondrejovič,, Miroslav (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Předložená dizertační práce se zabývá studiem biosyntézy polyhydroxyalkanoátů, jakožto mikrobiálního produktu s potenciálem nahradit současné konvenční plasty vyráběné z ropy. Dizertační práce je vypracovaná ve formě diskutovaného souboru již uveřejněných publikací, které jsou pak součástí práce ve formě příloh. Práce navazuje na poměrně rozsáhlé znalosti v oblasti produkce polyhydroxyalkanoátů a přináší nové skutečnosti a možné strategie. V rámci práce byly testovány rozličné možnosti analýzy polyhydroxyalkanoátů pomocí moderních metod, které přináší především rychlost, která může být klíčová při „real-time“ evaluaci produkčního biotechnologického procesu. Ramanova spektroskopie se ukázala jako velice perspektivní technika pro rychlou kvantifikaci PHA. Dále se práce zabývá valorizací odpadů potravinářského a zemědělského původu. Důraz je kladen především na metody detoxifikace hydrolyzátů lignocelulózy. V tomto kontextu byla poprvé využita adsorpce inhibitorů na lignin jako alternativa k dalším detoxifikačním technikám. Vybrané produkční kmeny Burkholederia cepacia a B. sacchari byly díky detoxifikaci schopné utilizovat hydrolyzát měkkého dřeva pro produkci PHA. V další části práce byla testována také možnost využítí kuřecího peří jako komplexního zdroje dusíku. V rámci práce bylo také využito evoluční inženýrství jako možná strategie pro eliminaci inhibičního účinku kyseliny levulové – mikrobiálního inhibitoru, který vzniká při hydrolýze lignocelulózových materiálů. Adaptačními experimenty byly z původního divokého kmene C. necator vyvinuty kmeny projevující se vyšší odolností ke kyselině levulové a schopné akumulovat kopolymer s vyšším zastoupením 3HV. Dalším slibným přístupem testovaným v rámci práce bylo využití extrémofilního mikrobiálního kmene, což vede ke snížení nákladů na biotechnologickou produkci. Vybrané druhy rodu Halomonas prokázaly vysoký potenciál jako halofilní producenti PHA. Závěrečná část práce se věnovala výběru produkčního kmene s ohledem na vlastnosti výsledného PHA. Kmen Cupriavidus malaysiensis byl vybrán za účelem produkce terpolymeru P(3HB-co-3HV-co-4HB) u kterého byly odhaleny značné rozdíly v materiálových vlastnostech oproti P3HB.
|
host ::
RSS.