|
|
Imunoskóre ve 3D tkáních
Novák, Jaromír ; Drbal, Karel (vedoucí práce) ; Procházka, Jan (oponent)
Pevné nádory představují komplexní struktury, které zahrnují kromě transformovaných buněk cévy, složky extracelulární matrix (ECM), rozpustné molekuly a širokou paletu různých typů buněk. Tyto složky dohromady tvoří nádorové mikroprostředí. Z buněčných typů, které jsou součástí nádorového mikroprostředí, mají největší vliv na prognózu pacienta tumor infiltrující lymfocyty (TIL). Jejich přítomnost navíc nabývá na významu i s rozvojem biologických terapií immune checkpoint inhibitory (ICIs). Stěžejní roli TIL reflektují i nové přístupy v diagnostice nádorů, ilustrované zejména metodou Imunoskóre (dnes používanou v klinické praxi), založenou na kvantifikaci a lokalizaci CD3+ a CD8+ TIL v tenkém řezu nádorovou tkání. Otevřenou otázkou zůstává, nakolik informace získaná z 2D řezu reflektuje skutečnou situaci v inherentně trojrozměrném nádorovém mikroprostředí. Je to zejména rozvoj nových metodických přístupů, které usnadňují získání 3D histologické informace je klíčový k zodpovězení této otázky. V teoretické části této práce je nejdříve nastíněna heterogenita nádorového mikroprostředí a role buněk imunitního systému v něm. Na množství příkladů je poté ilustrována role prostorové heterogenity a její případný vliv na histopatologické hodnocení nádoru s důrazem na TIL. Detailně je popsán vývoj, provedení,...
|
|
|
Leukaemia associated immunophenotype in childhood acute leukaemias and its development during the course of disease
Podolská, Tereza ; Fišer, Karel (vedoucí práce) ; Drbal, Karel (oponent)
Akutní lymfoblastická leukémie (ALL) je nejčastější dětskou malignitou. K jednomu z nedávných zlepšení v léčbě ALL došlo zavedením monitoringu minimální reziduální nemoci (MRD), který umožňuje přizpůsobit léčbu na základě stratifikace rizika. Monitoring MRD rovněž umožňuje zvolit vhodnou léčbu při relapsu onemocnění, indikovat transplantaci kmenových buněk (SCT) a umožňuje personalizovaný přístup k pacientům podstupujícím SCT. Jedním ze základních způsobů detekce hladiny MRD je charakterizace leukemických blastů pomocí průtokové cytometrie. Hlavním limitem průtokové cytometrie je však to, že analýza dat je manuální a závislá na vysoce expertních znalostech. Tento postup je subjektivní a ne zcela dostatečný pro analýzu komplexních datových souborů užívaných v současnosti. Přestože jsou dostupné nové výpočetní nástroje pro zpracování multidimenzionálních dat z průtokové cytometrie, je zároveň potřeba tyto metody otestovat a přizpůsobit je klinickému prostředí. Cílem této práce je detekovat imunofenotypy asociované s leukémiemi a jejich vývojem pomocí počítačem asistované analýzy u sady diagnostických souborů vybraných na základě informací o více než třech stech tisíců datasetů z víceparametrové průtokové cytometrie. Pokročilé bioinformatické nástroje pomohou detekovat blastické a zdravé...
|
|
|
Hematopoéza v rybím modelu dánia a medaky s možností xenotransplantace lidských hematopoetických kmenových buněk
Pravcová, Naďa ; Drbal, Karel (vedoucí práce) ; Svoboda, Ondřej (oponent)
Danio rerio (Dánio pruhované) a Oryzias latipes (Medaka japonská) jsou modelové organismy, jejichž popularita v oblasti studia hematopoézy v posledních letech stoupá. Důvodem jsou výhodné vlastnosti těchto modelů v porovnání s dalšími často používanými modely, především v porovnání s nejvíce používaným modelovým organismem Mus musculus (Myš domácí). Těmito výhodami jsou: krátká generační doba, velký počet potomků, možnost častého vytírání, vnější oplodnění a vývoj, průsvitnost embryí, snadná genetická manipulace na pozadí mnoha mutantních a transgenních linií, (především u dánia) a inbredních linií (u medaky). Mechanismy hematopoézy jsou z velké části konzervované mezi vyššími obratlovci a dániem i medakou. Jednou z nejdůležitějších vlastností je průsvitnost embryí a existence průsvitných mutantních linií dospělců. To umožňuje sledování hematopoetických kmenových buněk ("hematopoietic stem cells", HSC) in vivo. Vytvořením humanizovaných modelů xenotransplantací HSC můžeme sledovat přihojení, dělení a chování lidských HSC in vivo. V současnosti je nejpoužívanějším organismem pro xenotransplantaci lidských HSC myš. V myších modelech je ovšem nutná imunodeplece. Jedná se o invazivní proces zahrnující ozáření nebo genetické manipulace. U dánia a medaky je možné využít časového okna, ve kterém ještě...
|
|
|
Komparativní strukturní analýza povrchových virulentních faktorů Borreliella spp. se zaměřením na konzervovanost topologie jejich povrchu
Zdrha, Alois ; Drbal, Karel (vedoucí práce) ; Nunvář, Jaroslav (oponent)
Gram-negativnı́ bakterie rodu Borreliella jsou původcem dnes rozšiřujı́cı́ho se one- mocněnı́ lymeské borreliózy. Jejich zařazenı́ mezi gram-negativnı́ bakterie je ale zavádějı́cı́, jelikož se od nich značně odlišujı́ svým komplexnı́m genomem, patogennı́mi adaptacemi na hostitele a složenı́m své povrchové membrány. Jeden druh borreliell může obsahovat vedle jednoho konzervovaného chromozomu až 23 variabilnı́ch plasmidů. I přesto borre- liellám scházı́ mnoho důležitých proteinů pro syntézu klı́čových sloučenin, a proto musı́ tyto sloučeniny zı́skávat od hostitele. Aby borreliella mohla využı́vat metabolické procesy hostitele ke své reprodukci, musı́ nejdřı́ve hostitele infikovat a následně i přežı́t jeho imunitnı́ obranu. K tomu jı́ sloužı́ virulentnı́ faktory, mezi které patřı́ zejména značně variabilnı́ povrchové lipoproteiny. Právě variabilita těchto lipoproteinů ztěžuje využitı́ povrchových epitopů při detekci a následně i přı́padné protilátkové terapii, protože většina dominantnı́ch antigennı́ch epitopů borreliell se nacházı́ ve variabilnı́ch částech zmı́něných lipoproteinů. K určenı́ vhodných cı́lů pro protilátky dnes můžeme využı́t algoritmy, které sta- novı́ evolučně konzervované epitopy na základě...
|
|
|
Characterization of T-cell clones from naïve and virtual memory compartment
Přibíková, Michaela ; Štěpánek, Ondřej (vedoucí práce) ; Drbal, Karel (oponent)
Virtuálně paměťové (VM) CD8+ T buňky představují populaci tzv. antigeně-nezkušených T buněk, které mají centrálně paměťový fenotyp. Tvoří 10-20% všech periferních CD8+ T buněk v neimunizované bezmikrobní myši. Formují se z vysoce autoreaktivních T buněčných klonů na periferii prostřednictvím silných homeostatických signálů T-buněčného receptoru (TCR). V první části této diplomové práce bylo cílem porovnat TCR repertoáry VM a naivních CD8+ T buněk. Ukázali jsme, že obě skupiny buněk mají tyto repertoáry odlišné a T-buněčné podmnožiny navíc obsahují odlišné klonotypy. Dále jsme zjistili, že tzv. VM klony byly přítomny jak ve VM buňkách, tak i v naivních buňkách. Na druhou stranu tzv. naivní klony se vyskytovaly pouze v buňkách naivních. V druhé části této práce bylo cílem charakterizovat signalizaci jednotlivých OVA-reaktivních TCR z VM a naivní podmnožiny T buněk. Úspěšně jsme dokázali, že šest z osmi testovaných TCR odpovídají na Kb-OVA. V poslední části práce jsme navrhli a optimalizovali qPCR metodu, která je určena pro relativní kvantifikaci specifických T- buněčných klonotypů před a během imunitní odpovědi. Tato metoda bude sloužit jako efektivní nástroj pro studování biologie jednotlivých VM a naivních podmnožin T buněk a jejich role během imunitní odpovědi. Klíčová slova: T-buněčný receptor,...
|
|
|
Fibroblast activation protein and local immunosuppression in glioblastoma
Ternerová, Nikola ; Stollinová Šromová, Lucie (vedoucí práce) ; Drbal, Karel (oponent)
Multiformní glioblastom (GBM) je nejagresívnějším primárním mozkovým nádorem. Současná terapie je založena především na radikální resekci nádoru a následné chemo/radioterapii, přesto prognóza pacientů zůstává velmi nepříznivá s mediánem přežití pouze 15 měsíců. GBM se vyznačuje výskytem nekróz, abnormální vaskularizací a imunosupresí. Dynamické interakce nádorových buněk, imunitních buněk, ale i ostatních stromálních buněk v nádorovém mikroprostředí mohou vést k nádorovému růstu a progresi. Fibroblastový aktivační protein α (FAP) je zvýšeně exprimován v nádorových tkáních. FAP hraje významnou roli v angiogenezi, remodelaci extracelulární matrix a imunomodulaci v nádorové tkáni. Úloha FAP v nádorovém mikroprostředí je předmětem současného výzkumu. Cílem diplomové práce bylo připravit glioblastomový syngenní myší model s/bez exprese FAP, zavést a optimalizovat disociační metody GBM tkáně a detekovat v ní jednotlivé populace imunitních buněk pomocí průtokové cytometrie. Optimalizace disociačního protokolu pro tkáň glioblastomu byla kruciálním krokem v přípravě viabilní buněčné suspenze vhodné pro cytometrickou analýzu imunitních buněk. Buněčné suspenze s nejvyšší viabilitou bylo dosaženo pomocí disociace GBM tkáně za použití kombinace disociátoru a enzymů s mírnější enzymovou aktivitou. S úspěchem...
|
|
|
Zvýšená AID aktivita jako zdroj genomické nestability v klinicky relevantních nádorech
Vaníčková, Karolína ; Drbal, Karel (vedoucí práce) ; Macůrek, Libor (oponent)
AID je člen rodiny mutačních enzymů APOBEC. Deaminací cytosinu na uracil generuje v ssDNA nekomplementární U:G páry, které podléhají opravě chybovými DNA reparačními mechanismy. V B buňkách tak zvyšuje mutační nálož Ig lokusů v rámci reakce somatické hypermutace během afinitní maturace imunoglobulinů (Ig). Dále pomocí indukce dvouřetězcových zlomů umožňuje rekombinaci Ig během izotypového přesmyku nebo primární diverzifikaci Ig pomocí templátové genové konverze u některých druhů obratlovců. Při nedostatečné regulaci těchto indukčních a reparačních procesů získává AID tumorigenní potenciál a stává se zdrojem genomické nestability u nádorů. V epiteliálních tkáních je exprese AID aktivovaná prozánětlivými cytokiny pomocí kanonické dráhy NF-B. Původci jsou jak exogenní zdroje (Helicobater pylori nebo HCV), tak endogenní zdroje (žlučové kyseliny), i fyziologické procesy, například ovulace. Proto může být AID pojítkem mezi zánětem a nádory. Ve většině dokumentovaných případů se AID podílí na iniciaci tumorigeneze. Ektopická exprese AID v myších modelech vede ke vzniku karcinomů plic, jater, žaludku, orálních karcinomů a melanomů, v dalších případech se podílí také na epiteliálně-mezenchymálním přesmyku. V případech CML a adenokarcinomů plic je AID zodpovědná za progresi onemocnění a je zdrojem získané...
|
|
|
Průtoková cytometrie pro in vitro testy chemosenzitivity a rezistence nádorů (CSRA)
Drozdová, Tereza ; Drbal, Karel (vedoucí práce) ; Balounová, Jana (oponent)
In vitro testy chemosenzitivity a rezistence ("Chemosensitivity and resistance assay" - CSRA) nádorů stanovují citlivost konkrétního nádoru k daným léčebným postupům v experimentálním uspořádání. Heterogenní populace nádorových buněk je ex vivo krátkodobě vystavená působení různých schválených léčiv a jejich kombinací. Následně je stanoven vliv jednotlivých léků na životnost konkrétních nádorových buněk, podle níž je možné zvolit přesnou kombinaci léčiv pro každého pacienta individuálně. Tento přístup je příkladem personalizované medicíny, která se zabývá přizpůsobení diagnostických postupů a léčby konkrétnímu pacientovi, a tím se snaží zamezit selhání léčby u pacientů, u kterých nefungují statisticky nejúčinnější léčebné postupy, založené na randomizovaných klinických testech. Množství určování živých buněk pomocí průtokové cytometrie poskytuje velice přesnou statistiku pro multiparametrickou analýzu. Nezbytnou podmínkou je ovšem přítomnost disociovaných nádorových buněk v jednobuněčné suspenzi. Tím se tato metoda liší od klonovacích metod, kdy kolonie nádorových buněk rostou na agarových médiích, nebo od histokultur, které se vyznačují trojrozměrnou kultivací tkáně. Následně také můžeme roztřídit buňky podle jejich předem definovaných vlastností pro jejich další funkční testování. Výhodou těchto...
|
|
|
Vliv interferon regulujícího faktoru 3 na imunitní odpověď proti viru vakcínie v atopickém organismu
Pilná, Hana ; Mělková, Zora (vedoucí práce) ; Drbal, Karel (oponent)
Virus vakcínie (VACV) je obalený DNA virus z čeledi pohybuje kolem 200 kpb. Velká kapacita genomu umožňuje VACV kódovat řadu faktorů, které jsou postradatelné pro replikaci a šíření viru in vitro, avšak interferují s imunitní odpovědí hostitele. I přesto je VACV silně imunogenní. Buněčná i humorální imunitní odpověď u atopiků je do značné míry deregulována, což s případě infekce nebo při aplikaci vakcín na bázi replikace schopných virů přináší komplikace, jako např. způsobený VACV ověď spočívá mimo jiné v inhibici exprese interferonu (IFN) typu I, a to na mnoha úrovních - například prostřednictvím β následně indukuje expresi IFN a interferonem inducibilních genů. Při inhibici fosforylace a 3 k expresi těchto genů nedochází. Pro překonání tohoto bloku byl připraven rekombinantní VACV exprimující myší IRF IRF3). Již dříve bylo ověřeno, že exprese tohoto uměle vloženého IRF β imunitní odpověď spontánně atopického organismu, myší kmene Nc/Nga, a normálního organismu, myší kmene Balb/c. Dle získaných výsledků exprese rekombinantního IRF ovlivňuje především β β buněčných liniích a moduluje expresi řady cytokinů v kůžích obou pozorovaných myších kmenů. Imunizace pomocí WR IRF3 rovněž vede k navození lepší protektivní Klíčová slo β, 1β, myši kmene Nc/Nga, myši kmene Balb/c
|
|
|
Cytometric assay of antigen-specific T cell response in monitoring of BCG vaccine therapy
Hadlová, Petra ; Drbal, Karel (vedoucí práce) ; Kalina, Tomáš (oponent)
Karcinom močového měchýře patří mezi nejčastější karcinomy v západním světě. Navzdory dlouhodobému výzkumu a existenci efektivních terapeutických možností přetrvává potřeba vyvinout stratifikační metodu, která umožní identifikovat pacienty odpovídající na léčbu. V teoretické části své diplomové práce jsem popsala heterogenitu karcinomu močového měchýře, jako modelové patologie a terapeutické přístupy, které se v současnosti uplatňují. Obzvlášť jsem se soustředila na terapii založenou na instilaci Bacillus Calmette-Guérin (BCG). BCG je po desetiletí používaná jak při léčbě karcinomu močového měchýře, tak jako preventivní vakcína proti infekční tuberkulóze (TB). BCG slouží jako modelová terapie, protože u odpovídajících pacientů je vysoce účinná. Nicméně, pro zlepšení diagnostiky a monitorování průběhu onemocnění karcinomu močového měchýře a latentní tuberkulózy (LTBI) chybí účinná stratifikační metoda. V experimentální části své práce jsem navrhla a testovala 10 parametrický panel pro detekci T buněčné odpovědi na aktivaci (TAT) pro budoucí využití při stratifikaci pacientů s nádorem močového měchýře a pro detekci (LTBI). Panel jsem testovala na pozitivních kontrolách metodou průtokové cytometrie, která umožňuje detegovat desítky znaků na jednotlivých buňkách. Je dobře využitelná pro zpracování a...
|
host ::
RSS.