|
|
Regulation of Epithelial-Mesenchymal transition by the ERK pathway.
Čáslavský, Josef ; Vomastek, Tomáš (vedoucí práce) ; Brábek, Jan (oponent) ; Gregor, Martin (oponent)
Epiteliální tkáň se skládá z uniformních, polarizovaných buněk, které jsou mezi sebou propojeny řadou kohezivních kontaktů napojených na aktinový cytoskelet. Přestože na první pohled epitel působí jako pevná a neměnná struktura, během různých fyziologických a patofyziologických dějů zahrnujících embryonální vývoj či rozvoj nádorů, může epiteliální tkáň výrazně měnit své charakteristické rysy. V těchto dějích epiteliální buňky mohou podstupovat nejrůznější morfologické změny, které zahrnují ztrátu polarity, rozrušení mezibuněčných spojení a iniciaci individuální buněčné migrace. Tyto změny v morfologii jsou souhrnně označované jako epitelo-mesenchymální tranzice a umožnují buňkám efektivně prostupovat do okolních tkání. Předpokládá se, že jsou hlavním faktorem umožnující šíření nádorových buněk. Signální dráha ERK, která se skládá se ze tří sekvenčně aktivovaných proteinkináz RAF, MEK a ERK, hraje důležitou úlohu v přeměně epitelialní tkáně na individuálně migrující buňky. Důležitou efektorovou proteinkinázou v rámci zmíněné signální dráhy je kináza ERK. ERK fosforyluje celou řadu proteinů jak v cytoplazmě, tak i v jádře a jejich fosforylace následně řídí různé buněčné odpovědi. Otázkou zůstává, jakým způsobem signální dráha ERK řídí transformaci epiteliálních buněk na individuálně migrující buňky....
|
|
|
Úloha signální dráhy ERK v regulaci genů časné odpovědi
Chvalová, Věra ; Vomastek, Tomáš (vedoucí práce) ; Doubravská, Lenka (oponent)
Signální dráha ERK představuje evolučně konzervovaný mechanismus, který buňkám umožňuje vnímat extracelulární signály a převádět je v široké spektrum specifických intracelulár- ních odpovědí, jako je proliferace, diferenciace, apoptóza či buněčná migrace. Mezi klíčové prvky této dráhy patří proteinkinázy Raf, MEK a efektorová proteinkináza ERK. Konstitutivní aktivace dráhy ERK, způsobená somatickými mutacemi některých jejích členů, se často objevuje u mnoha typů lidských nádorových onemocnění. Tato dráha proto hraje významnou roli i z biomedicín- ského hlediska. Zmíněné fyziologické i patologické děje jsou podmíněny především schopností signální dráhy ERK regulovat změny v expresi velkého množství genů. Po aktivaci proteinkinázy ERK dochází k její translokaci do jádra, kde fosforyluje rozličné transkripční faktory. To vede k jejich aktivaci a následně k několikastupňovým změnám v genové expresi. Nejdříve dochází k tran- skripci genů tzv. časné odpovědi (immediate early genes; IEGs), z nichž mnoho kóduje další tran- skripční faktory, jako jsou c-Fos, c-Jun či c-Myc. Ty následně regulují expresi genů tzv. sekun- dární odpovědi (secondary response genes, SRGs), které kódují další strukturní či signalizační proteiny. Hromadné změny v genové expresi poté vedou k funkčnímu přeprogramování buněk. V této...
|
|
| |
|
|
Spatiotemporal regulation of Lck activity in the initiation of TCR signalling
Ballek, Ondřej ; Filipp, Dominik (vedoucí práce) ; Černý, Jan (oponent) ; Vomastek, Tomáš (oponent)
Dizertační práce: Časoprostorová regulace aktivity kinázy Lck při zahájení TCR signalizace Ondřej Ballek Abstrakt T-lymfocyty jsou bezpochyby nejvíce studovanými buňkami imunitního systému. Jsou klíčovými hráči specifické imunity zodpovědnými za cílenou odpověď proti patogenům a jiným signálům nebezpečí. Díky jejich centrálnímu významu vede často jakákoliv porucha regulace jejich aktivity k imunopatologiím. Znalost jejich bio destruktivní efektorové funkce je tedy velice zásadní. Dodnes panují rozpory, jakým molekulárním mechanismem probíhá zahájení T-buněčné aktivace. Po rozeznání specifického antigenu prostřednictvím antigen-prezentující buňky a T-buněčného receptoru je aktivační signál přenesen přes plasmatickou membránu, kde následuje fosforylace cytoplasmatických částí T-receptorového komplexu. Tato událost je obecně považována za první biochemický znak aktivace T-lymfocytů v procesu zvaném "TCR triggering". Jak se však aktivační signál dostane do buňky a jaké mechanismy regulují samotné zahájení signalizace, jsou dvě základní, avšak dosud nezodpovězené, otázky. V této práci jsme se zaměřili především na mechanismy regulace T-buněčné aktivace a tři související problémy. V prvním jsme se zabývali časoprostorovou organizací důležitých signálních molekul před a po aktivaci T-lymfocytů v kontextu tzv....
|
|
|
Signaling mechanism in nuclear reorientation and its functional singnificance in cell migration.
Maninová, Miloslava ; Vomastek, Tomáš (vedoucí práce) ; Hodný, Zdeněk (oponent) ; Jaroš, Josef (oponent)
Prvním důležitým krokem buněčné migrace je ustavení buněčné polarity. Na procesu polarizace buněk se podílí řada signálních drah, jejichž regulace je v přední a zadní části buňky řízena různým způsobem. To buňce umožňuje zaujmout specifický tvar s typickou předo-zadní polaritou. Během polarizace buňka formuje vedoucí lamelipodii na přední části a váznoucí konec na zadní části buňky. Zároveň dochází k takovému přeuspořádání vnitrobuněčných organel, které je pro buněčnou migraci optimální. V migrujících buňkách, jako jsou fibroblasty, se buněčné jádro nachází v zadní části buňky a mikrotubuly organizující centrum relokalizuje mezi jádro a čelo buňky. Takové uspořádání uvnitř buňky je nezbytnou podmínkou pro efektivní směrovanou migraci. V této práci jsme ukázali, že pro polarizaci buněk je nezbytná také takzvaná reorientace jádra. Reorientace jádra je rotační pohyb, ke kterému dochází v prvních hodinách buněčné polarizace a umožňuje reorientaci delší osy jádra do směru migrace. Reorientace jádra pak napomáhá ustavení buněčné polarity a usnadňuje pohyb buněk. Aby buňka mohla reorientovat své jádro do směru migrace, je nutné, aby bylo napojeno na buněčný cytoskelet. Připojení jádra k jednotlivým komponentám cytoskeletu zprostředkovává takzvaný LINC (Linker of Nucleoskeleton and Cytoskeleton) komplex. V...
|
|
|
Radiation-induced plasticity of prostate cancer cells
Kyjacová, Lenka ; Hodný, Zdeněk (vedoucí práce) ; Bouchal, Jan (oponent) ; Vomastek, Tomáš (oponent)
Rezistence různých typů nádorů ke konvenční léčbě radiací nebo chemoterapeutiky patří mezi nejčastěji zkoumané fenomény v oblasti molekulární a klinické onkologie. Pro rekurentní onemocnění je charakteristická přítomnost metastáz, které jsou v 90% odpovědné za úmrtí pacientů. Frakcionované ionizující záření (fIR; fractionated ionizing radiation) v kombinaci s chirurgickým odstraněním nádoru nebo hormonální terapií představuje nejčastější typ léčby v případě lokalizovaného nebo lokálně pokročilého karcinomu prostaty (KP). Hlavní příčinou neúspěchu radioterapie KP je radiorezistence s následnou diseminací přeživších buněk do okolních tkání. Ve snaze lépe pochopit fenotyp buněk asociovaný s radiorezistencí jsme vystavili čtyři buněčné linie KP derivované z metastáz (DU145, PC-3, LNCaP a 22RV1) klinicky relevantním, denně se opakujícím dávkám ionizujícího záření (fIR; 35 x 2 Gy), což mělo za následek vznik dvou přeživších buněčných populací - adherentních buněk vykazujících známky senescence včetně exprese markerů asociovaných se senescencí a neadherentních buněk rezistentních k anoikis, s rysy kmenových buněk, včetně aktivní sinalizace Notch a exprese kmenových znaků CD133, Oct-4, Sox2 a Nanog. Zatímco radiorezistentní adherentní buňky byly schopné obnovit proliferaci krátce po skončení ozařování,...
|
|
|
Regulation of leukocyte signal transduction by adapter proteins with special focus on Csk anchoring proteins
Drobek, Aleš ; Brdička, Tomáš (vedoucí práce) ; Brábek, Jan (oponent) ; Vomastek, Tomáš (oponent)
Signalizace přes receptory leukocytů je nedílnou součástí homeostáze imunitního systému a naprosto kritická pro imunitní odpověď. Iniciace signálu a jeho šíření musí být správně kontrolováno aby se aktivace imunitního systému nezvrhla v patologickou. Důležitou úlohu v zahájení signalizace a její regulaci hrají adaptorové proteiny. Tyto adaptory se podílejí na pozitivní nebo negativní kontrole, případně mají duální funkci. Jejich funkce je určena aktivitou enzymů, které na sebe váží. V předkládané práci jsme se zabývali dvěma adaptorovými proteiny, PSTPIP2 a LST1/A, a jejich funkcí v signalizaci leukocytů. Oba adaptory na sebe váží několik enzymů s inhibiční funkcí což poukazuje na jejich úlohu v negativní regulaci signalizace. Rozšířili jsme současné znalosti o vzniku a vývoji zánětlivého onemocnění označovaného jako chronická multifokální osteomyelitida, které se rozvíjí u myší v důsledku deficience v expresi adaptoru PSTPIP2, tím, že jsme popsali interakce tohoto adaptoru s kinázou Csk a fosfatázou SHIP1. Konkrétně jsme ukázali, že absence PSTPIP2 vede ke zvýšené aktivitě signálních drah a zvýšenému štěpení IL-1β v neutrofilech v odpovědi na celou řadu stimulací, a že vazba SHIP1 přispívá k potlačování zánětu zprostředkovanému adaptorem PSTPIP2. Biochemická analýza druhého adaptorového proteinu,...
|
|
|
Objasnění vlivu proteinkináz ERK1 a ERK2 na iniciaci translace nezávislé na čepičce
Přibyl, Miroslav ; Vopálenský, Václav (vedoucí práce) ; Vomastek, Tomáš (oponent)
Proteinkinázy ERK1 a ERK2 jsou jedny z nejstudovanějších proteinů buněčné signalizace. Oba proteiny se podílejí na velkém množství procesů ať už fosforylací proteinových substrátů nebo aktivací proteinkináz, které jsou součástí dalších signálních drah. Enzymy ERK1 a ERK2 jsou součástí MAPK/ERK signální kaskády, která je spojována s mnoha buněčnými ději, jakými jsou například buněčná proliferace, buněčný růst nebo diferenciace. Signální kaskáda MAPK/ERK je často silně aktivována v různých typech rakovinných bujení a je jedním z cílů vývoje nízkomolekulárních inhibitorů v léčbě nádorových onemocnění. Jednou z hlavních otázek základního výzkumu proteinů ERK1 a ERK2 je rozdílnost obou proteinkináz. Přestože mnohé poznatky poukazují na redundanci těchto proteinů, objevují se i poznatky tvrdící opak. Nedávná publikace skupiny Casanova et al. 2012 nepřímo poukazuje na rozdílný vliv proteinkináz ERK1 a ERK2 na iniciaci translace, která není závislá na čepičce, nýbrž na vnitřním vazebném místě pro ribozom, IRES. V Laboratoři biochemie RNA se už dlouho zabýváme iniciací translace zprostředkovanou HCV IRES (z ang. Hepatitis C Virus Internal Ribosome Entry Site, Vnitřní vazebné místo pro ribozomu viru žloutenky typu C). Tato diplomová práce vedla k zavedení metody RNA interference v naší laboratoři a vytvoření...
|
|
|
Identification of a new mechanism of Lck regulation via its C-terminal sequence
Valečka, Jan ; Filipp, Dominik (vedoucí práce) ; Vomastek, Tomáš (oponent)
Aktivace T-lymfocytů je složitý proces zcela zásadní pro správnou funkci imunitního systému. Jako takový byl v minulosti důkladně zkoumán a jeho základní rysy jsou velmi dobře popsány. Neplatí to ovšem pro všechny události, které během T-buněčné signalizace nastávají. Po stimulaci T-buněčného receptoru kináza Lck z rodiny Src zajišťuje spuštění signalizace fosforylací tyrosinů. Fosforylace dalších proteinů je závislá na přesunutí Lck do jiných kompartmentů plazmatické membrány, takzvaných lipidových raftů. V lipidových raftech je Lck v blízkosti svých substrátů, které a aktivuje a které následně spouští další signalizaci. Kritickou částí tohoto procesu je translokace Lck do lipidových raftů, jejíž mechanismus zůstává dosud neprozkoumaný, a jako takový je objektem značného akademického i klinického zájmu. Již dříve jsme identifikovali adaptorový protein RACK1 jakožto kandidátní protein zprostředkovávající redistrubuci Lck do lipidových raftů pomocí propojení Lck s mikrotubulární sítí. V této práci jsme analyzovali strukturní znaky a funkci RACK1 v interakci s Lck. S využitím buněčných linií SYF exprimující buď přirozené nebo různě mutované formy Lck zde ukazujeme, že plně funkční SH3 a SH2 domény Lck jsou nezbytné pro efektivní vytvoření komplexu RACK1-Lck. Také jsme zjistili malý, ale...
|
|
|
Úloha signální kaskády ERK v regulaci aktinového cytoskeletu a morfologických změn epiteliálních buněk
Rasl, Jan ; Vomastek, Tomáš (vedoucí práce) ; Tolde, Ondřej (oponent)
Signální kaskáda ERK patří mezi základní signální dráhy eukaryotických buněk, která reaguje na široké spektrum podnětů a následně se podílí na vytvoření konkrétní odpovědi. Ukazuje se, že signální kaskáda ERK indukuje rozpad architektury epitelu a indukuje morfologické změny vedoucí k zisku autonomie epiteliálních buněk. Během rozvolnění epiteliální struktury se signální kaskáda ERK účastní remodelace aktinového cytoskeletu, což má za následek ztrátu epiteliální polarity, rozvolnění mezibuněčných spojů a následně spuštění migračního programu, který umožňuje epiteliálním buňkám využít mezenchymálního způsobu migrace. Jednou z nejméně prozkoumaných aktinových struktur epiteliálních buněk je tzv. periferní aktin, kontraktilní aktinová struktura, která obemyká kolonie epiteliálních buněk. Periferní aktin se nachází na bazální straně buněk a pravděpodobně se podílí na udržení integrity epitelu. Nicméně dodnes není známo, jestli, a popřípadě jakým způsobem, se signální kaskáda ERK účastní na regulaci periferního aktinu a jestli remodelace periferního aktinu hraje roli v buněčné migraci. V této práci ukazujeme, že signální kaskáda ERK je důležitá pro remodelaci periferního aktinu. Akivace signální kaskády ERK vede k rozrušení této aktinové struktury a jejího nahrazení dendritickým aktinem lamellipodia a...
|
host ::
RSS.