|
| |
|
|
Katalytická funkce DNA dependentních RNA polymeráz
Sýkora, Michal ; Vopálenský, Václav (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent)
DNA dependentní RNA polymeráza je vysoce organizovaný proteinový komplex, který je zodpovědný za genovou expresi a její regulaci. Vícepodjednotková RNA polymeráza se svými několika katalytickými aktivitami je zodpovědná za transkripci genů do RNA kopií u všech buněčných organismů. Při transkripci podstupuje RNA polymeráza značné konformační změny v závislosti na podmínkách v konkrétní buňce. RNA polymeráza ve stavu označovaném jako elongační komplex prochází opakovanými cykly přidání nukleotidu k rostoucímu řetězci RNA. Aktivní centrum RNA polymerázy obsahuje dva hořečnaté ionty, které koordinují reaktivní skupiny substrátů. Dále aktivní centrum obsahuje strukturní prvky, jež se účastní vazby substrátu, správné orientace substrátu vůči templátovému vláknu a translokace RNA polymerázy. Nejdůležitější z těchto pohyblivých strukturních prvků jsou mostový helix a spouštěcí smyčka, jejichž konformační změny cyklus přidání nukleotidu doprovázejí. Pokroky v strukturní a biochemické charakterizaci RNA polymerázy otevírají nové možnosti v porozumění transkripčního mechanismu, jeho přesnosti a kontroly.
|
|
|
Factors affecting gene expression in Bacillus subtilis
Sudzinová, Petra ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Vopálenský, Václav (oponent) ; Vohradský, Jiří (oponent)
Klíčovým enzymem bakteriální transkripce je DNA-závislá RNA-polymeráza (RNAP). Její aktivita musí být přesně kontrolována. Tato kontrola může nastat na úrovni rozeznání různých verzí promotorové DNA, v různém stavu nadšroubovicovitého vinutí. Dále také pomocí změn ve vnitrobuněčné koncentraci metabolitů, nebo pomocí vazby proteinů, které se nazývají transkripční faktory. I když byla RNAP a její regulační síť intenzivně studována po desítky let, stále nové a nové regulátory jsou objevovány. Hlavním cílem této doktorské práce je představit několik z nich: i) HelD, nový protein, který se váže na RNAP, a jehož trojrozměrná struktura zatím není známa; ii) RNázu J1, enzym s novým mechanismem funkce; iii) Spx, důležitý regulátor genové exprese v Bacillus subtilis, jehož všechny funkce zatím nejsou popsány a iv) vliv nadšroubovicovitého stavu promotorové DNA na transkripci. V Publikaci I jsme popsali HelD protein jako nového vazebného partnera RNAP z Bacillus subtilis a charakterizovali jsme jeho biochemické vlastnosti. HelD zvyšuje transkripci tím, že pomáhá recyklovat molekuly RNAP, a tato aktivace je závislá na ATP. V Publikaci III jsme prezentovali první vhled do trojrozměrné struktury HelD pomocí metody SAXS a popsali jsme doménové složení HelD proteinu. A v Publikaci VI jsme vyřešili strukturu...
|
|
|
Syntéza proteinů obsahujících nekanonické aminokyseliny
Knetl, Adam ; Vopálenský, Václav (vedoucí práce) ; Plocek, Vítězslav (oponent)
0 Abstrakt: Nekanonické aminokyseliny umožňují vkládat nové chemické vlastnosti do proteinů, což je užitečné jak pro zkoumání stávajících proteinů, tak i pro design proteinů nových. Syntéza proteinů obsahujících nekanonické aminokyseliny se setkává s problémy efektivity translace. Tato práce se zabývá rolí genetického kódu pro kódování nekanonických aminokyselin, proteosyntézou a aminoacylací tRNA a konečně samotnými nekanonickými aminokyselinami a jejich využitím v proteinech včetně příkladů.
|
|
|
Příprava a využití systému pro studium regulace genové exprese kvasinkových lineárních cytoplasmatických plasmidů
Horáčková, Kamila ; Vopálenský, Václav (vedoucí práce) ; Čáp, Michal (oponent)
O translaci lineárních cytoplasmatických plasmidů vyskytujících se u kvasinky Kluyveromyces lactis existují pouze velmi kusé informace. V současné době je poměrně dobře prozkoumán jejich transkripční aparát i celý transkriptom. Studium transkriptů lineárních plasmidů odhalilo velmi netypické uspořádání jejich 5ʼ konců, které obsahují netemplátovou polyadenylaci a postrádají N7 methylguanosinovou čepičku. Právě přítomnost této struktury na 5ʼ konci plasmudů specifických mRNA vyvolalo otázku iniciace translace. Tato práce se zabývala přípravou reportérového systému vhodného pro studium vlivu počtu netěmplátově přidaných adenosinů na 5ʼ konec mRNA lineárních plasmidů. Prvním krokem byla konstrukce duálního kvasinkového plasmidu nesoucího dva reportérové geny pod kontrolou dvou různých promotorů. Po jeho úspěšné konstrukci byla měřena aktivita promotorů TEF1 a PGK1, kdy se promotor TEF1 ukázal cca dvakrát silnější. Rovněž byl stanoven transkripční start obou promotorů. Druhým krokem byla konstrukce reportérového systému rovnou v kvasinkových plasmidech pGKL. Reportérové geny byly pod kontrolou dvou promotorů pocházejících z pGKL plasmidů iniciujících vznik trankriptů s různou strukturou. Po měření síly promotorů se ukázalo, že jejich síla je v porovnání s promotory TEF1 a PGK1 velmi nízká, až...
|
|
|
Factors affecting gene expression in Bacillus subtilis
Sudzinová, Petra ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Vopálenský, Václav (oponent) ; Vohradský, Jiří (oponent)
Klíčovým enzymem bakteriální transkripce je DNA-závislá RNA-polymeráza (RNAP). Její aktivita musí být přesně kontrolována. Tato kontrola může nastat na úrovni rozeznání různých verzí promotorové DNA, v různém stavu nadšroubovicovitého vinutí. Dále také pomocí změn ve vnitrobuněčné koncentraci metabolitů, nebo pomocí vazby proteinů, které se nazývají transkripční faktory. I když byla RNAP a její regulační síť intenzivně studována po desítky let, stále nové a nové regulátory jsou objevovány. Hlavním cílem této doktorské práce je představit několik z nich: i) HelD, nový protein, který se váže na RNAP, a jehož trojrozměrná struktura zatím není známa; ii) RNázu J1, enzym s novým mechanismem funkce; iii) Spx, důležitý regulátor genové exprese v Bacillus subtilis, jehož všechny funkce zatím nejsou popsány a iv) vliv nadšroubovicovitého stavu promotorové DNA na transkripci. V Publikaci I jsme popsali HelD protein jako nového vazebného partnera RNAP z Bacillus subtilis a charakterizovali jsme jeho biochemické vlastnosti. HelD zvyšuje transkripci tím, že pomáhá recyklovat molekuly RNAP, a tato aktivace je závislá na ATP. V Publikaci III jsme prezentovali první vhled do trojrozměrné struktury HelD pomocí metody SAXS a popsali jsme doménové složení HelD proteinu. A v Publikaci VI jsme vyřešili strukturu...
|
|
|
The role of elF3 a Rps3 in stop codon readthrough
Poncová, Kristýna ; Valášek, Leoš (vedoucí práce) ; Vopálenský, Václav (oponent) ; Krásný, Libor (oponent)
Translace představuje složitě regulovaný a vysoce provázaný proces výroby proteinů v buňce. Má několik základních fází-iniciaci, elongaci, terminaci a recyklaci ribosomů. Naše laboratoř se zabývá studiem multifaktoriálního komplexu eukaryotického iniciačního faktoru 3 (eIF3). Zajímá nás nejen odhalování jeho molekulárních rolí v průběhu translačního cyklu, ale také jeho úloha při specifických mechanismech, které se podílí na regulování translace v závislosti na buněčných potřebách. eIF3 se skládá v kvasinkách z pěti esenciálních podjednotek (a/Tif32, b/Prt1, c/Nip1, g/Tif35 a i/Tif34). V savcích je jeho složení komplexnější s 12 podjednotkami (a-i, k-m). eIF3 je klíčový hráč nejen v iniciaci translace, ale také ve fázi recyklace ribosomů a překvapivě i v translační terminaci a pročítání stop kodonu. Posledně zmiňovaný proces má velký klinický potenciál, jelikož téměř 1/3 geneticky podmíněných onemocnění je způsobena přítomností předčasného terminačního kodonu v protein kódující oblasti. Porozumění molekulárním detailům pročítání stop kodonu a translačně terminační mašinérie je důležité pro další vývoj selektivních a méně toxických léčiv vhodných k terapii. V této disertační práci jsem popsala jak protein malé ribosomální podjednotky Rps3 řídí efektivitu rozpoznávání stop kodonu. Identifikovala jsem...
|
|
|
Vývoj techniky pro transfer genů do T-lymfocytů pomocí polyomavirových struktur a peptidu LAH4
Schreiberová, Lucie ; Španielová, Hana (vedoucí práce) ; Vopálenský, Václav (oponent)
Efektivní doprava genetického materiálu do T-lymfocytů je klíčová při genové terapii využívající T-lymfocyty s chimérickými antigenními receptory. Dosavadní postupy vyžadují použití potenciálně nebezpečných virových vektorů nebo velké množství vstupního materiálu. Diplomová práce se proto soustředí na prozkoumání nových přístupů pro transfer genů do T-lymfocytů: využití bezpečných viru podobných částic (VLP) odvozených od myšího polyomaviru v kombinaci s amfipatickým kationickým peptidem LAH4. LAH4 má potenciál zvyšovat efektivitu dopravy DNA i virových vektorů do buněk. Systém kombinující VLP a peptid LAH4 byl optimalizován pro dopravu reportérových genů (kódujících GFP a luciferázu) do modelové T-lymfocytární linie Jurkat. Bylo zjištěno, že pomocí VLP se zabalenou DNA nelze efektivně transdukovat buňky Jurkat. Při transfekci buněk samotnou DNA s LAH4 nebylo dosaženo konzistentních výsledků a efektivita transfekce se pohybovala od 0,5 do 19 %. V rámci diplomové práce byl také analyzován vliv fosforylace virových struktur na transfer genů. Byl studován dopad opůsobení virových částic alkalickou fosfatázou na infektivitu viru a bylo nutné analyzovat vliv reakčních složek. Sublytická koncentrace Tritonu-X100 v reakčním pufru pozitivně ovlivňovala infektivitu MPyV více než vlastní defosforylace. V...
|
|
|
The effect of selected endogenous and exogenous factors on bacterial growth
Šiková, Michaela ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Valášek, Leoš (oponent) ; Vopálenský, Václav (oponent)
Růst bakteriální kultury binárním dělením je klíčovou charakteristikou těchto organismů. Tento růst závisí na dvou typech faktorů: endogenní a exogenní. Endogenní faktory tvoří molekulární aparát buněk. Mezi důležité endogenní faktory patří rovněž ty, které se podílejí na genové expresi a její regulaci. Mezi exogenní faktory řadíme dostupnost živin, teplota, pH, různé stresy nebo přítomnost antibiotik. Hlavním cílem mé dizertační práce bylo studium vlivů vybraných endogenních a exogenních faktorů na bakteriální růst. Jako endogenní faktory jsem studovala RNázu J1 u Bacillus subtilis a malou RNA zvanou Ms1 u Mycobacterium smegmatis, které se podílejí na regulaci genové exprese na úrovni transkripce. Ukazuji zde, že RNáza J1 může, kromě své role v degradaci RNA, hrát roli v genomové integritě odstraněním zastavených komplexů RNA polymerázy (RNAP) z DNA. Dále ukazuji, že Ms1 se váže na jádro RNAP a má vliv na množství RNAP v buňce. Výsledky odhalují nové mechanistické aspekty transkripčního aparátu a ukazují, jak jednotlivé komponenty nebo kombinace ovlivňují bakteriální růst. Jako exogenní faktory jsem studovala nedávno objevené antibakteriální látky zvané lipofosfonoxiny a jejich interakci s bakteriemi, bakteriálními proteiny a vliv na bakteriální růst. Stručně řečeno, tato práce posouvá naše...
|
|
|
Vliv deaminasy adenosinu v RNA na virovou infekci eukaryotických buněk
Kubů, Martin ; Vopálenský, Václav (vedoucí práce) ; Fraiberk, Martin (oponent)
Dvouvláknová RNA, molekula běžně se v buňkách nevyskytující, je typickým znakem virových infekcí. Tato molekula také slouží jako substrát enzymů skupiny ADAR, které způsobují konversi adenosinu na inosin, který je obvykle následně rozpoznáván buněčnou mašinérií jako guanosin. Kromě této editační aktivity interagují enzymy skupiny ADAR i s různými buněčnými proteiny, jako například s komplexem Dicer a s protein kinázou R, což spolu s editací dsRNA ovlivňuje replikaci virů. V této práci jsou zpracovány informace o antivirální aktivitě enzymů skupiny ADAR a jejich vlivu na infekci vybraných, zejména lidských, virů.
|
host ::
RSS.