|
|
Regulation of Epithelial-Mesenchymal transition by the ERK pathway.
Čáslavský, Josef ; Vomastek, Tomáš (vedoucí práce) ; Brábek, Jan (oponent) ; Gregor, Martin (oponent)
Epiteliální tkáň se skládá z uniformních, polarizovaných buněk, které jsou mezi sebou propojeny řadou kohezivních kontaktů napojených na aktinový cytoskelet. Přestože na první pohled epitel působí jako pevná a neměnná struktura, během různých fyziologických a patofyziologických dějů zahrnujících embryonální vývoj či rozvoj nádorů, může epiteliální tkáň výrazně měnit své charakteristické rysy. V těchto dějích epiteliální buňky mohou podstupovat nejrůznější morfologické změny, které zahrnují ztrátu polarity, rozrušení mezibuněčných spojení a iniciaci individuální buněčné migrace. Tyto změny v morfologii jsou souhrnně označované jako epitelo-mesenchymální tranzice a umožnují buňkám efektivně prostupovat do okolních tkání. Předpokládá se, že jsou hlavním faktorem umožnující šíření nádorových buněk. Signální dráha ERK, která se skládá se ze tří sekvenčně aktivovaných proteinkináz RAF, MEK a ERK, hraje důležitou úlohu v přeměně epitelialní tkáně na individuálně migrující buňky. Důležitou efektorovou proteinkinázou v rámci zmíněné signální dráhy je kináza ERK. ERK fosforyluje celou řadu proteinů jak v cytoplazmě, tak i v jádře a jejich fosforylace následně řídí různé buněčné odpovědi. Otázkou zůstává, jakým způsobem signální dráha ERK řídí transformaci epiteliálních buněk na individuálně migrující buňky....
|
|
|
Identification of novel substrates of PKN3 kinase and characterization of the role of phosphorylation in the regulation of Rho GAP activity
Dibus, Michal ; Rösel, Daniel (vedoucí práce) ; Vomastek, Tomáš (oponent) ; Petrák, Jiří (oponent)
Proteínová fosforylácia predstavuje jednu z najdôležitejších posttranslačných modifikácií v signálnom prenose a zohráva kľúčovú úlohu v regulácii väčšiny bunkových procesov, vrátane bunkového cyklu, komunikácie s extracelulárnym prostredím, bunkovej migrácie, alebo apoptózy. Fosforylácia je sprostredkovaná kinázami, deregulácia ktorých často negatívne ovplyvňuje vývoj a celkovú homeostázu a vedie k vzniku viacerých druhov ochorení, vrátane rakoviny. V tejto práci sme sa zamerali na identifikáciu nových substrátov kinázy PKN3, ktorá je známym regulátorom organizácie cytoskeletu a pro-malígneho rastu nádorov. Za použitia analóg-senzitívnej mutácie PKN3 sme urobili fosfoproteomický screen a identifikovali sme 281 proteínov, ktoré by potenciálne mohli byť fosforylované kinázou PKN3. Spomedzi týchto proteínov sme pre ďalší výskum vybrali ARHGAP18 z rodiny Rho GAP proteínov. Potvrdili sme, že PKN3 je schopná fosforylovať ARHGAP18 na Thr154, Ser156 a Thr158, a že tieto proteíny sú schopné vzájomnej interakcie v závislosti na izoforme ARHGAP18. Ďalej sme ukázali, že zámena týchto troch miest za fosfomimikujúci aspartát viedla k aktivácii GAP domény ARHGAP18, výsledkom čoho došlo k zníženiu hladiny aktívneho RhoA naznačujúc možnú existenciu negatívnej spätnej väzby v regulácii RhoA signalizácie. V druhej...
|
|
|
Regulatory mechanisms of centrosomal microtubule nucleation
Klebanovych, Anastasiya ; Dráber, Pavel (vedoucí práce) ; Hašek, Jiří (oponent) ; Vomastek, Tomáš (oponent)
SOUHRN Organizace a dynamika mikrotubulů se mění s ohledem na potřeby buňky při jejím růstu, dělení a diferenciaci, a také při vnitrobuněčném transportu i přenosu signálů. Centrozomální mikrotubuly se tvoří pomocí γ-tubulinových komplexů (γTuRC). Ačkoliv signální dráhy regulující mikrotubulární nukleaci zůstávají do značné míry neznámé, posttranslační modifikace stavebních proteinů γTuRC a jejich interakčních partnerů hrají důležitou úlohu při modulaci nukleace. V předkládané disertační práci jsme funkčně charakterizovali úlohu protein tyrosin fosfatázy SHP-1 a E3 UFM-protein ligázy 1 (UFL1) interagující s proteinem CDK5RAP3 (C53) při regulaci centrozomální mikrotubulární nukleace. Rovněž jsme v tomto procesu objasnili roli profilinu 1, regulačního proteinu aktinových filament. Zjistili jsme, že SHP-1 v žírných buňkách kostní dřeně (BMMC) tvoří komplexy s γTuRC proteiny a inhibuje nukleaci mikrotubulů snížením množství γ-tubulinu/γTuRC v centrozómech. Navrhli jsme nový mechanismus, při kterém aktivní centrozomální Syk kináza, fosforylovaná na tyrosinu a regulovaná SHP-1, moduluje nukleaci mikrotubulů během aktivace BMMC pomocí antigenu. Poprvé jsme ukázali, že proteinový komplex UFL1/C53 se může podílet na regulaci nukleace mikrotubulů. Protein C53, jehož množství je regulováno UFL1, se váže na centrozómy....
|
|
|
The role of ERK1 and ERK2 protein kinases in the MAPK/ERK signaling
Galvánková, Kristína ; Vomastek, Tomáš (vedoucí práce) ; Dráber, Peter (oponent)
MAPK/ERK je naprieč organizmami vysoko konzervovaná signálna dráha, zabezpečujúca procesy nevyhnutné pre život, akými sú proliferácia, diferenciácia, apoptóza alebo migrácia buniek. Všetky tieto procesy sú výsledkom spracovania celej rady extracelulárnych signálov prenášaných od receptorov cez kaskádu proteínkináz Raf, MEK a ERK pomocou následných fosforylácií. Raf fosforyluje MEK a MEK fosforyluje a aktivuje proteínkinázu ERK, ktorá následne fosforyluje a tým reguluje široké spektrum substrátov na rôznych miestach v bunke. Keďže ostatné dve proteínkinázy majú obmedzený počet substrátov, práve ERK fosforyláciou stoviek popísaných substrátov v daný moment zásadne vplýva na konečnú odpoveď bunky. Ovplyvnené substráty potom určujú výslednú bunkovú odpoveď na extracelulárny signál. Celá signálna dráha je v jednotlivých krokoch prísne regulovaná za pomoci interakčných partnerov a ďalších adaptorových proteínov. Nesprávna regulácia dráhy, ako aj mutácie jednotlivých proteínkináz vedú k závažným patologickým prejavom. Na úrovni proteínkinázy ERK sa vyskytujú dve izoformy, ERK1 a ERK2, ktoré sú z viac než 80 % identické. Ich veľká sekvenčná aj funkčná podobnosť vyvoláva otázky o ich evolučnej konzervovanosti a taktiež o tom, či majú tieto izoformy rozdielne funkcie, alebo sú funkčne zameniteľné. Cieľom...
|
|
|
Mechanisms of phenotypic plasticity induced by genotoxic stress
Přibyl, Miroslav ; Hodný, Zdeněk (vedoucí práce) ; Remešová, Hana (oponent) ; Vomastek, Tomáš (oponent)
Rezistence nádorových buněk vůči léčbě představuje hlavní důvod neúspěšné nádorové terapie. Růst nádorových buněk v primárním místě nádoru nebo jejich šíření a růst v sekundárních oblastech jsou hlavní důvody, proč pacienti nemoci podlehnou. I moderní terapie založené na aktivaci imunitního systému nachází své hranice u mnohých typů nádorů. Rezistence vůči léčbě je zprostředkována nejen nádorovými buňkami, ale i jinými komponenty nádorového mikroprostředí. Porozumění mechanizmům nádorové rezistence zprostředkované nádorovými buňkami, ale i nádorovému mikroprostředí umožní vývoj nových terapeutických přístupů. V této práci představujeme naše nedávné výsledky. Ozařování, 5-azacytidin i IFNγ indukují expresi genu suprabasin (SBSN) a vznik fenotypu nádorových buněk, který je zodpovědný za resistenci vůči terapii a projevuje se nízkou adhezivitou a kmenovými vlastnostmi nádorových buněk. Snížení exprese genu SBSN vedlo k potlačení tohoto fenotypu. Rovněž jsme identifikovali aberantně zvýšenou expresi genu SBSN v kostní dřeni podskupiny pacientů trpících myelodysplastickými syndromy (MDS). Exprese SBSN byla zprostředkována supresorovými buňkami odvozenými z myeloidní řady (MDSCs) a hladina SBSN negativně korelovala se zastoupením T buněk a koncentrací CCL2 v kostní dřeni pacientů. Z toho vychází možný...
|
|
|
Mechanism of regulation of EGFR receptor ligand activation via the intramembrane pseudoprotease iRhom and cell surface metalloprotease ADAM17
Trávníčková, Květa ; Stříšovský, Kvido (vedoucí práce) ; Vomastek, Tomáš (oponent)
Signalisace skrz receptor pro epidermální růstový faktor (EGF receptor, EGFR) podléhá propracované a mnohovrstevné regulaci. Jedním ze způsobů vylaďování signalisace zprostředkované tímto receptorem je kontrola produkce jeho ligandů. U savců za uvolňování solubilních, biologicky aktivních forem ligandů EGF receptoru zodpovídají především metaloproteasy ADAM10 a ADAM17. Pseudoprotease iRhom z rodiny rhomboid-like proteinů byla nedávno připsána úloha klíčového positivního regulátora ADAM17. U drosofily však je iRhom spjat s negativní regulací EGF receptoru, a to prostřednictvím degradace prekursorů jeho ligandů. Experimenty prováděné v savčích buněčných kulturách ovšem naznačují, že podobná funkce by mohla být zachována i u savčích iRhomů. V této diplomové práci byl studován vliv overexprese iRhomu na expresní úroveň ligandů EGF receptoru. Na rozdíl od dřívějších publikací však nebylo potvrzeno, že by pozorovaný efekt bylo možno vysvětlit výlučně přítomností iRhomu, neboť neaktivní mutanti rhomboidních proteas jej působili rovněž. Také nebylo prokázáno, že by iRhom takto ovlivňoval pouze ligandy EGF receptoru - strukturně podobné, avšak ligandům EGF receptoru nepříbuzné proteiny v přítomnosti iRhomu taktéž podléhaly depleci. Koexprese ADAM17 mizení ligandů EGF receptoru zamezila, avšak pouze v...
|
|
|
Vývoj biofyzikální interpretace dat kvantitativního fázového zobrazování
Křížová, Aneta ; Jákl, Petr (oponent) ; Vomastek, Tomáš (oponent) ; Chmelík, Radim (vedoucí práce)
Doktorská práce se zabývá biofyzikální interpretací dat kvantitativního fázového zobrazování (QPI – quantitative phase imaging) získaného pomocí koherencí řízeného holografického mikroskopu (CCHM – coherence-controlled holographic microscope). V práci jsou nejprve popsány metody vyhodnocující informace z QPI jako analýza tvarových a dynamických cha-rakteristik segmentovaných objektů a také vyhodnocování samotné fázové informace. Dále je navržena metoda dynamických fázových diferencí (DPD – dynamic phase differences), která umožňuje detailněji sledovat přesuny hmoty uvnitř buněk. Všechny uvedené metody jsou pak využity v biologických aplikacích. V rozsáhlé studii různých typů buněčných smrtí jsou informace z QPI porovnány s daty z průtokové cytometrie a s výhodou je využita kombinace QPI a fluorescenční mikroskopie. Metoda DPD je pak využita při studiu přesunů hmoty uvnitř buňky při osmotických jevech. Zjednodušená metoda DPD je aplikována při výzkumu mechanizmu pohybu nádorových buněk v kolagenových gelech.
|
|
|
Analyzing the role of the p130Cas SH3 domain in p130Cas-mediated signaling
Gemperle, Jakub ; Rösel, Daniel (vedoucí práce) ; Vomastek, Tomáš (oponent) ; Truksa, Jaroslav (oponent)
IN CZECH Adaptorový protein p130Cas (CAS, BCAR1) propojuje signalizaci od integrinových receptorů s receptory růstových faktorů a ovlivňuje správný embryonální vývoj a tkáňovou homeostázu. Jeho změněná exprese může vyvolat mnoho patologických stavů, včetně nádorového bujení, metastazování a rezistence vůči různým protinádorovým lékům. Molekulární mechanismy, jakými p130Cas přispívá k různým patologickým stavům nejsou zatím jednoznačně popsány. Cílem mé doktorské práce bylo tedy poskytnout nové poznatky o signalizaci p130Cas a o její regulaci. Doména SH3 je nepostradatelná pro signalizaci proteinu p130Cas, ale její vazebné preference/regulace nebyly dosud přesně charakterizovány ani strukturně popsány. Proto jsme začali spolupracovat se skupinou Dr. Veverky (Strukturní biologie) a Dr. Lepšíkem (Výpočetní biochemie, AV ČR). S jejich pomocí jsme pak připravili fúzní chiméry SH3 domény proteinu p130Cas se svými ligandy a provedli strukturní analýzu NMR, která nám pomohla strukturně popsat atypický vazebný motiv SH3 domény proteinu p130Cas. Díky této spolupráci jsem se navíc naučil, jak tyto struktury vizualizovat a analyzovat. Tato práce rozšířila naše znalosti o regulaci vazby mezi p130Cas SH3 a jejími ligandy a dále vedla k vylepšenému modelu vazby mezi Src-p130Cas-FAK. Naše snaha sledovat aktivitu...
|
|
|
Quality control in snRNP biogenesis
Roithová, Adriana ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Malínský, Jan (oponent) ; Vomastek, Tomáš (oponent)
v češtině snRNP patří k nejdůležitějším částem sestřihového komplexu. Jejich životní cyklus se odehrává v cytoplasmě, kde probíhají první fáze jejich biogeneze, a také v jádře, kde plní svoji hlavní funkci. Všechny snRNP jsou složeny z krátké nekódující RNA, z Sm či LSm proteinů tvořící 7-členný kruh a z proteinů specifických pro každý snRNP. Jejich životní cyklus začíná v jádře, kde jsou transkribovány RNA polymerázou II nebo III. Poté jsou transportovány do cytoplasmy. Během své cytoplasmatické fáze se formuje Sm kruh kolem specifické sekvence na RNA pomocí SMN komplexu a následně se trimetyluje čepička na 5'konci snRNA. Tyto 2 úpravy jsou signálem, že je snRNP připravena na transport do jádra, kde je hromaděna v jaderných strukturách nazývající se Cajalova tělíska. V Cajalových tělískách probíhá finální část jejich zrání. Průběh snRNP biogeneze je průběžně kontrolován. První kontrola probíhá v jádře ihned po jejich transkripci a následuje vytvoření exportního komplexu. Druhý kontrolní bod je v cytoplasmě a zahrnuje tvorbu Sm kruhu. Víme, že Sm kruh je tvořen SMN komplexem ale detailní mechanismus je stále neznámý. Pokud snRNA neprojde těmito kontrolními body, tak je v cytoplasmě degradována. Avšak, jak buňka rozlišuje mezi normálními a defektními snRNA se stále neví. Třetí a poslední kontrolní...
|
|
|
Mechanismus vzniku perinukleárních aktinových mikrofilament a jejich funkce v buněčné motilitě
Votavová, Barbora ; Vomastek, Tomáš (vedoucí práce) ; Cvačková, Zuzana (oponent)
Pohyb jádra, ke kterému dochází během buněčné migrace a invazivity, je aktivní proces z velké části zprostředkovaný aktino-myozinovým cytoskeletem. Klíčovou roli v přenosu aktino-myozinových sil na jádro hraje proteinový komplex LINC, který se skládá z proteinů SUN a nesprin a který mechanicky spojuje jadernou laminu a cytoskelet. Komplex LINC asociuje s tzv. perinukleárními aktinovými vlákny, která jsou jeho pomocí zakotvená v jaderné obálce. Perinukleární aktinová vlákna jsou zakotvena také ve fokálních adhezích a tak mechanicky spojují extracelulární matrix s komplexem LINC a jádrem. Jelikož perinukleární aktinová vlákna jsou kontraktilní, lze předpokládat, že generují síly, které regulují pohyb jádra a tak optimalizují buněčný pohyb. V této práci jsme se zaměřili na roli perinukleárních aktinových vláken během buněčné migrace. Hlavním cílem diplomové práce bylo objasnit mechanizmy, které se podílí na tvorbě perinukleárních aktinových vláken a jak tyto mechanizmy usnadňují migraci buněk. Práce byla zaměřena na charakterizaci úlohy signální dráhy LPA - RhoA při vzniku perinukleárních aktinových vláken, úlohy jednotlivých součástí LINC komplexu v zakotvení aktinových vláken do jaderné obálky a jaký vliv mají tato vlákna na migraci nenádorových a nádorových buněk. Působení LPA bylo potvrzeno jako...
|
host ::
RSS.