|
| |
|
|
Podjednotka delta bakteriální RNA polymerázy a její role v regulaci genové exprese u Bacillus subtilis
Dvořáček, Lukáš ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Vopálenský, Václav (oponent)
Podjednotka delta bakteriální RNA polymerázy a její role v regulaci genové exprese u Bacillus subtilis. V této práci se zabývám regulací genové exprese u eubakterií. V první cásti shrnuji soucasné poznatky o klícové fázi genové exprese - transkripci, blíže se pak zameruji na regulaci iniciace transkripce pomocí malých efektorových molekul (guanosin tetrafosfát, iniciacní nukleosid trifosfát) u genu pro ribozomální RNA. Ve druhé, experimentální cásti této práce se zabývám rolí relativne málo studované podjednotky RNA polymerázy z gram pozitivních bakterií - proteinu _ - pri iniciaci transkripce a jejího vlivu na regulaci RNA polymerázy pomocí koncentrace iniciacního nukleosid trifosfátu.
|
|
|
Chladová adaptace ve stacionární fázi u Bacillus subtilis
Beranová, Anna ; Konopásek, Ivo (vedoucí práce) ; Svobodová, Jaroslava (oponent)
Chladová adaptace ve stacionární fázi u Bacillus subtilis Teplota je jedním z nejdůležitějších abiotických faktorů, které ovlivňují život bakteriální buňky. Nízká teplotu snižuje fluiditu cytoplazmatické membrány. Zatímco chladová adaptace u Bacillus subtilis během exponenciální fáze je relativně dobře prozkoumána, adaptace během stacionární fáze doposud systematicky prozkoumána nebyla. Stacionární fáze růstu je přitom nejobvyklejším stavem, ve kterém se mikroorganismy v přírodě vyskytují. Bakterie Bacillus subtilis uplatňují dva nezávislé mechanismy, kterými potřebnou fluiditu membráně navrací - krátkodobou a dlouhodobou adaptaci. Krátkodobá adaptace je závislá na funkci desaturázy mastných kyselin (kódované genem des), dlouhodobá adaptace spočívá ve změně poměru iso- a anteiso- větvených mastných kyselin ve fosfolipidech membrány. V této práci byla sledována adaptace membrány na stálou nízkou teplotu a na náhlé snížení teploty během stacionární fáze. Při stálé nízké kultivační teplotě, byla zaznamenána nejvyšší aktivita promotoru des při 25 řC, po náhlém snížení teploty byla zjištěna největší aktivita po přenosu z kultivační teploty 37 řC do 25 řC. Měřením anizotropie a analýzou mastných kyselin bylo zjištěno, že membrána stacionárních buněk kultivovaných při 37 řC je méně fluidní než membrána...
|
|
|
Vývoj analytických metod pro stanovení fosforylovaných složek bakteriálních buněčných membrán
Mikulecká, Jana ; Čabala, Radomír (vedoucí práce) ; Feltl, Ladislav (oponent)
Fosfolipidy jsou dominantními komponentami bakteriálních buněčných membrán, v nichž tvoří fosfolipidové dvojvrstvy. Bakterie se liší svým fosfolipidovým složením, což umožňuje stanovení a identifikaci významných skupin mikroorganismů. Lze však sledovat i změnu fosfolipidového zastoupení u bakterií stejného druhu, protože složení je ovlivněno celou řadou environmentálních podmínek. K identifikaci a stanovení bakteriálních fosfolipidů se běžně využívá tenkovrstvá chromatografie zejména pro svou minimální instrumentaci. Nevýhodou této metody je časová náročnost a požadavky na pečlivost a zručnost pracovníka. Rostoucí zájmem o fosfolipidové dvojvrstvy napomáhá k podrobnějšímu prozkoumání složení mastných kyselin, neboť detailnější analýzy umožňují zjistit o mikroorganismech ještě více. Pro tyto účely se zdá být tou nejlepší volbou plynová chromatografie spojená s hmotnostní spektrometrií. Metoda slouží jak k identifikaci, tak k určení celkového zastoupení mastných kyselin v molekule fosfolipidu. Dále je využívána k určení polohy a počtu izomerií dvojných vazeb a funkčních skupin na uhlovodíkovém řetězci. Zatímco pro identifikaci a stanovení nepolárních částí fosfolipidů již existuje vhodná a osvědčená analytická ...
|
|
|
Účinek surfaktinu na lipidovou složku cytoplazmatické membrány Bacillus subtilis
Sklenářová, Petra ; Seydlová, Gabriela (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent)
Surfaktin, sekundární metabolit produkovaný bakterií Bacillus subtilis, je povrchově aktivní látka a antibiotikum, které permeabilizuje membránovou dvouvrstvu. Cílem této diplomové práce bylo zjistit, jaké adaptivní změny na úrovni lipidové složky cytoplazmatické membrány mohou přispívat k přežití B. subtilis v koncentracích surfaktinu, které bakterie jiných druhů zabíjí. Neprodukční kmen B. subtilis 168 byl kultivován v přítomnosti dvou různých subletálních koncentrací surfaktinu (350 a 650 µg/ml) izolovaného z kultury produkčního kmene B. subtilis ATCC 21332. Přídavek surfaktinu do média vedl v závislosti na koncentraci k zástavě růstu exponenciální kultury na 40 min (350 µg/ml), resp. 3 h (650 µg/ml) a poté se růst obnovil se změněnou dobou zdvojení. Nižší koncentrace způsobila 20% urychlení růstu, u vyšší naopak došlo k prodloužení doby zdvojení na dvojnásobek oproti kontrole. Surfaktin vyvolal v cytoplazmatické membráně zásadní změny ve složení fosfolipidů. Došlo ke snížení podílu majoritního fosfolipidu membrány fosfatidylglycerolu a naopak zvýšení podílu fosfatidyletanolaminu, u koncentrace surfaktinu stimulující růst se navíc výrazně navýšil podíl kyseliny fosfatidové. Měření kinetiky lyze lipozómů tvořených lipidy mimikujícími složení membrány vystavené surfaktinu prokázalo, že zvýšení...
|
|
|
RNA polymerase: The "meeting point" of regulatory networks
Wiedermannová, Jana ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Pospíšek, Martin (oponent) ; Valášek, Leoš (oponent)
Bakteriální RNA polymeráza (RNAP) je proteinový komplex nepostradatelný pro přepis DNA do RNA. Jakožto klíčový enzym zodpovědný za regulaci genové exprese shromažďuje signály z buňky a reaguje na ně přesným nastavením úrovně transkripce jednotlivých genů. Tento proces ovlivňují jak vlastní podjednotky RNAP tak i další transkripční faktory (TF), které přímo nebo nepřímo interagují s RNAP. Cílem této disertace bylo prohloubit znalosti o komplexitě transkripční regulační sítě a o provázanosti jejích jednotlivých nitek, které jsou stále objevovány. Hlavním tématem této PhD práce je protein HelD, nově objevený vazebný partner RNAP z bakterie Bacillus subtilis. Ukázali jsme, že HelD se váže mezi sekundární kanál RNA polymerázy a alfa podjednotky tohoto enzymu. HelD se váže na RNAP ve formě jádra (bez přítomnosti sigma faktoru). Dokázali jsme, že HelD stimuluje transkripci v závislosti na ATP tím, že napomáhá jejímu cyklování a elongaci. Stimulační efekt proteinu HelD je násoben působením podjednotky delta, malé podjednotky RNA polymerázy specifické pro gram positivní (G+) bakterie. Tento fakt odhalil nové vztahy v provázanosti komplikované transkripční sítě. Další dvě publikace této práce pojednávají o vlastní delta podjednotce. Pomocí nukleární magnetické rezonance (NMR) jsme vyřešili 3D strukturu a...
|
|
|
Vliv lipidového složení membrány na odolnost vůči surfaktinu
Pinkas, Dominik ; Seydlová, Gabriela (vedoucí práce) ; Sýkora, Jan (oponent)
Surfaktin je antibiotikum produkované některými kmeny B. subtilis. Jeho široká škála biologických aktivit, zajímavá jak z hlediska medicínského, potravinářského či environmentálního, je založená na povrchové aktivitě a na interakci s cytoplazmatickými membránami. V těch je surfaktin schopen tvořit iontové kanály, póry a se vzrůstající koncentrací je úplně dezintegrovat detergentním mechanizmem. Mechanizmus rezistence producenta vůči vlastnímu produktu není zatím zcela objasněný. Tato práce ukazuje, že by se mohla odehrávat na úrovni změny zásahového místa - lipidového složení membrány. Metodou BLM bylo na membránách všech testovaných složení zaznamenáno široké spektrum kanálů s velkým rozdílem vodivostí v rozpětí větším než 2 pS až 2 nS. Měřením úniku karboxyfluoresceinu z lipozómů bylo rozlišeno několik distinktních mechanizmů lyze surfaktinem lišících se kooperativitou, rychlostí průběhu i mírou účinnosti. Dále bylo zjištěno, že zejména nárůst koncentrace aniontových fosfolipidů s kónickou geometrií - kardiolipinu a kyseliny fosfatidové vede ke zvýšené odolnosti membrán vůči permeabilizačnímu účinku surfaktinu. Klíčová slova: membrána, surfaktin, Bacillus subtilis, kardiolipin, černé lipidické membrány, lipozómy
|
|
|
Úloha genu yxkO Bacillus subtilis v odpovědi na environmentální stres.
Petrovová, Miroslava ; Lichá, Irena (vedoucí práce) ; Nešvera, Jan (oponent)
ÚLOHA GENU YXKO BACILLUS SUBTILIS V ODPOVĚDI NA ENVIRONMENTÁLNÍ STRES Abstrakt Mutace v genu yxkO, který kóduje hypotetickou ribokinázu a patří do regulonu σB obecné stresové odpovědi, vede u Bacillus subtilis ke snížené osmotoleranci za nízkých koncentrací draslíku v médiu. Biologická funkce genu yxkO zatím nebyla popsána, ale mohla by být zapojena do vysokoafinního transportního systému pro draselné ionty, který na rozdíl od Escherichia coli nebyl u Bacillus subtilis doposud objeven. Našim cílem bylo popsat další vlastnosti mutanta v genu yxkO a pokusit se navrhnout úlohu tohoto genu. Použitím integračního vektoru pMutin4 jsme připravily kmen MP2 Bacillus subtilis, který má gen yxkO inaktivovaný. Kmen MP2 vykazuje zpomalený růst v bohatém médiu a je senzitivní k tetracyklinu. Tento kmen dále není schopný vytvářet endospory a buňky jsou delší, což naznačuje poruchu tvorby příčných sept. Metodou dvourozměrné elektroforézy jsme porovnaly proteinové profily kmene MP2 a standardního kmene 1A680 po osmotickém a ethanolovém stresu. U kmene MP2 jsme pozorovaly změny v expresi některých enzymů energetického metabolismu a flagelinu. Závěr naší práce je, že yxkO je regulačním genem, jehož produkt má pleiotropní vliv na mnoho buněčných funkcí.
|
|
|
Vliv vyřazení genu yxkO při adaptaci na enviromentální stres u rodu Bacillus.
Tkadlec, Jan ; Lichá, Irena (vedoucí práce) ; Krásný, Libor (oponent)
V předchozích letech jsme v naší laboratoři popsali mutanta Bacillus subtilis, který vykazoval snížený růst při vystavení osmotickému stresu za limitující koncentrace K+ . Tento mutantní kmen nesl přerušení v genu yxkO kódujícím předpokládanou ribokinázu. Tento gen patřící do sigma B operonu je indukován osmotickým, teplotním a etanolovým šokem. Při srovnání s divokým kmenem, má tato mutace pleiotropní vliv na fenotyp nositelského kmenu. Kromě osmosenzitivity se mutant liší tvarem buňky, schopností motility a sporulace. Naším cílem bylo zaměřit se na projevy mutace v genu yxkO u dalších bakterií z rodu Bacillus. Připravili jsme mutanty s přerušením tohoto genu, pomocí plazmidu pMUTIN4, odvozené od kmenů lišících se okolím tohoto genu a úrovní laboratorní domestikace Bacillus amyloliquefaciens a Bacillus subtilis subsp. spizizenii. Obdobně jako v předchozích studijích (u laboratorního kmenu Bacillus subtilis 168) jsme popsali u mutantního kmenu odvozeného od Bacillus amyloliquefaciens zhoršenou schopnost růstu při limitaci draslíkem a za osmotického šoku. Tento fenomén jsme studovali na úrovni dynamiky růstu bakteriální kultury. Dále jsme detekovali zvýšenou citlivost kmenu odvozeného od Bacillus amyloliquefaciens k tetracyklinu, změnu morfologie těchto buněk a jejich motility. Mutace v přírodním...
|
|
|
Factors affecting gene expression in Bacillus subtilis
Sudzinová, Petra ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Vopálenský, Václav (oponent) ; Vohradský, Jiří (oponent)
Klíčovým enzymem bakteriální transkripce je DNA-závislá RNA-polymeráza (RNAP). Její aktivita musí být přesně kontrolována. Tato kontrola může nastat na úrovni rozeznání různých verzí promotorové DNA, v různém stavu nadšroubovicovitého vinutí. Dále také pomocí změn ve vnitrobuněčné koncentraci metabolitů, nebo pomocí vazby proteinů, které se nazývají transkripční faktory. I když byla RNAP a její regulační síť intenzivně studována po desítky let, stále nové a nové regulátory jsou objevovány. Hlavním cílem této doktorské práce je představit několik z nich: i) HelD, nový protein, který se váže na RNAP, a jehož trojrozměrná struktura zatím není známa; ii) RNázu J1, enzym s novým mechanismem funkce; iii) Spx, důležitý regulátor genové exprese v Bacillus subtilis, jehož všechny funkce zatím nejsou popsány a iv) vliv nadšroubovicovitého stavu promotorové DNA na transkripci. V Publikaci I jsme popsali HelD protein jako nového vazebného partnera RNAP z Bacillus subtilis a charakterizovali jsme jeho biochemické vlastnosti. HelD zvyšuje transkripci tím, že pomáhá recyklovat molekuly RNAP, a tato aktivace je závislá na ATP. V Publikaci III jsme prezentovali první vhled do trojrozměrné struktury HelD pomocí metody SAXS a popsali jsme doménové složení HelD proteinu. A v Publikaci VI jsme vyřešili strukturu...
|
host ::
RSS.