|
|
Functional and Pathophysiological-morphological Correlates of Neurodegenerative Diseases
Dušek, Pavel ; Roth, Jan (vedoucí práce) ; Baláž, Marek (oponent) ; Menšíková, Kateřina (oponent)
Tato dizertační práce vykresluje neurodegenerativní onemocnění jako víceúrovňový pro- ces, popisuje různé koreláty na jednotlivých patofyziologických úrovních a prezentuje vybrané koreláty na příkladu Huntingtonovy nemoci a neurodegenerace asociované s mi- tochondriálním membránovým proteinem (MPAN). Pro tyto účely používá různé me- todologické přístupy jako základní laboratorní výzkum, klinickou práci, zobrazování a vytvoření databáze s databázovými výstupy. Popisuje změny množství komplexu I a komplexu IV dýchacího řetězce v buňkách bukálního epitelu pacientů s Huntingtonovou nemocí. Demonstruje nedostatečnou diagnostickou sílu optické koherenční tomografie při použití jako biomarkeru u Huntingtonovy nemoci. Shrnuje různé fenotypy MPAN a potvrzuje asociaci mutace genu pro C19orf12 a poruchy zraku. Dále prezentuje dobře dokumentovaný případ pacienta s MPAN. Klíčová slova: akumulace železa; barevná diskriminace; huntingtin; Huntingtonova nemoc; komplex dýchacího řetězce; kontrastní senzitivita; mutace C19orf12; neurode- generace; neurodegenerace asociovaná s mitochondriálním membránovým proteinem; optická koherenční tomografie; parkinsonismus; tloušťka vrstvy nervových vláken sít- nice;...
|
|
|
Monitorování vlivu mutovaného huntingtinu na autofagii v lidských nervových kmenových buňkách
Zezulová, Kristýna ; Vodička, Petr (vedoucí práce) ; Kohoutek, Jiří (oponent)
Huntingtonova choroba je dědičné neurodegenerativní onemocnění způsobené mutací v genu Huntingtin. Jeho exprimovaný produkt, mutovaný protein huntingtin, v buňce agreguje a ovlivňuje rozsáhlou škálu buněčných procesů, včetně mechanismů proteostáze. Autofagie, řazena k mechanismům buněčné degradace a recyklace proteinů i jiných buněčných komponent, je jedním z procesů narušených přítomností mutovaného huntingtinu. Cílem projektu bylo s použitím chemicky kompetentních bakterií metodami molekulárního klonování připravit tandemový genetický konstrukt (fúzní protein LC3-EGFP-mCherry) v plazmidu se savčím promotorem, transfekovat jej do připravených lidských linií, nesoucích jak normální, tak mutovaný huntingtin, a modifikovat tak linie k přechodné, a pokud možno i trvalé, expresi tohoto senzoru aktivity autofagie. Takto modifikované linie umožňují sledovat vliv přítomnosti normálního a mutovaného HTT na průběh autofagie a také poskytují experimentálně vhodné podmínky k ovlivnění autofagie v těchto buňkách pomocí inhibitorů a aktivátorů ze skupiny malých molekul. Podařilo se molekulárním klonováním připravit dva typy fúzních proteinů LC3-GFP-mCherry/RFP a přechodně je vpravit lipofekcí do kontrolních ARPE19 linií. Konstrukty se z důvodu selhání transfekce či selhání exprese nepodařilo transfekovat do...
|
|
|
Charakterizace vlivu lidského mutovaného huntingtinu na diferenciaci nervových kmenových buněk.
Budková, Kateřina ; Vodičková, Kateřina (vedoucí práce) ; Romanyuk, Natalyia (oponent)
Huntingtonova choroba (HD) je autozomálně dominantní neurodegenerativní onemocnění způsobené expanzí repetice CAG kodonu v genu huntingtin (HTT). Tato expanze způsobuje změnu biochemických vlastností proteinu huntingtinu (HTT), jeho agregaci a buněčnou toxicitu, což vede k degeneraci neuronů mozku zejména v oblasti striata. Jako modelový systém pro in vitro modelování tohoto onemocnění mohou sloužit indukované pluripotentní buňky odvozené přímo z buněk pacientů s HD. Jelikož k neuronálním dysfunkcím dochází u pacientů s HD již roky před manifestací prvních klinických příznaků, může tento modelový systém pomoci objasnit mechanismy, které předcházejí nástupu onemocnění. Cílem této diplomové práce bylo diferencovat iPSC (odvozené z fibroblastů HD pacientů a zdravých kontrol) do nervových kmenových buněk (NSC) a následně do populací neuronálních buněk a sledovat molekulární změny v jejich diferenciaci spojené s vlivem mutovaného HTT. Proces diferenciace byl sledován na základě vybraných markerů pomocí imunofluorescence, metody western blot a qRT-PCR. Podařilo se nám vytvořit stabilní linie NSC odvozených ze 3 kontrolních a 3 HD iPSC linií. Všech 6 linií NSC bylo schopno dále diferencovat do neuronálních populací. Na transkripční úrovni jsme nalezli vyšší expresi genu ADAM10 v HD NSC liniích a vyšší...
|
|
|
Huntington's disease modeling and stem cell therapy in spinal cord disorders and injury
Hruška-Plocháň, Marián ; Motlík, Jan (vedoucí práce) ; Bjarkam, Carsten (oponent) ; Roth, Jan (oponent)
Neurologické poruchy postihují více než 14 % světové populace a společně s traumatickým poškozením mozku a míchy představují významnou zdravotní a socioekonomickou zátěž. Výskyt dědičných a idiopatických neurodegenerativních poruch a akutních poškození CNS navíc zaznamenává globální nárůst a neurovědecká komunita je proto stavěna před množství nezodpovězených otázek. To je důvodem, proč lze pokládat výzkum poruch CNS za klíčový. Vzhledem k tomu, že zvířecí modely nemocí a traumatických poškození CNS mají nepostradatelnou úlohu v projekci výsledků základního výzkumu do klinické praxe, tato práce je zaměřena na vytvoření nových zvířecích modelů a jejich využití v preklinickém výzkumu. Vytvořili a charakterizovali jsme transgenní model miniaturního prasete pro Huntingtonovu chorobu, jenž je doposud jediným prasečím modelem a představuje velice hodnotný subjekt pro dlouhodobé testování bezpečnosti léčby. Dále jsme zkřížili již charakterizovaný myší model Huntingtonovy choroby s myším modelem gad postrádajícím expresi UCHL1 s výsledky, které potvrzují teorii o "ochranné" funkci agregátů mutovaného huntingtinu a vedou k předpokladu, že funkce UCHL1 v ubiquitin proteazomového systému mohou být v Huntingtonově chorobě narušené. Traumatické poškození a amyotrofická laterální skleróza (ALS) jsou dvěma...
|
|
|
Monitorování vývoje onemocnění Huntingtonovy choroby u transgenních miniprasat s N-terminální částí lidského mutovaného huntingtinu: biochemické a motorické změny u F0, F1 a F2 generace
Kučerová, Šárka ; Ellederová, Zdeňka (vedoucí práce) ; Klempíř, Jiří (oponent)
Huntingtonova choroba (HD) patří mezi neurodegenerativní onemocnění, od kterých se liší příčinou (expanze trinukleotidové repetice CAG v exonu 1 genu kódující protein huntingtin (Htt)) pouze v jednom genu (tzv. monogenní onemocnění). Ačkoliv je již od roku 1993 známá příčina nemoci, dosud není zcela známa patofyziologie HD a není nalezen lék. Pro lepší porozumění nemoci a pro možné preklinické testování se používají modely HD. Mezi nejčastěji používané modely patří hlodavci, hlavně myši, ale bylo důležité vytvořit i větší zvířecí modely, které by byly více podobné člověku. Proto bylo v roce 2009 vytvořeno na Akademii věd v Liběchově transgenní (TgHD) miniprase pomocí mikroinjikace lentivirového vektoru nesoucí N-terminální část lidského mutovaného HTT (mtHTT) s 124 CAG repeticemi v exonu 1. Tento model je životaschopný a v každé generaci se rodí určitá část Tg zvířat. V této práci jsem se věnovala biochemickým i behaviorálním změnám u tohoto modelu. Srovnávala jsem kontrolní (Wt) a transgenní (Tg) sourozence. Zjistila jsem, že biochemické změny se projevují hlavně zvýšenou přítomností fragmentů Htt ve varlatech a v mozku. V behaviorální části bylo mým hlavním úkolem zavedení metodiky pro další zkoumání behaviorálních změn u tohoto modelu, které zatím nebyly popsány. Byla testována zvířata F0, F1 a...
|
|
|
Vzájemný vztah mutovaného huntingtinu a pre-rakovinového stadia u savčích buněk.
Butalová, Nikola ; Baxa, Monika (vedoucí práce) ; Koudelková, Lenka (oponent)
Huntingtonova choroba je závažné dědičné onemocnění, které způsobuje odumírání nervových buněk. Nemoc postihuje jedince okolo 40. roku života. Projevuje se mimovolními pohyby končetin a progresivní demencí. Toto onemocnění je v současné době neléčitelné a vždy končí smrtí, která nastává do 15 let od projevů prvních příznaků. Na konci 20. století byl pozorován zvláštní vztah mezi Huntingtonovou chorobou a maligní neoplazií, který poukazuje na nižší výskyt rakoviny mezi pacienty s tímto neurodegenerativní onemocněním oproti běžné populaci. Za ochranný účinek proti vývoji rakoviny u těchto osob je pravděpodobně zodpovědná expandovaná sekvence CAG úseku. Pro kvalitní studium této choroby bylo velmi důležité vytvoření vhodného experimentálního modelu, který bude svými vlastnostmi nejvíce podobný člověku. Tímto modelem by mohlo být transgenní miniprase nesoucí lidský mutovaný protein huntingtin - tgHD prase. Pro studium rakoviny byl také vytvořen model miniprasete vykazující dědičný výskyt maligních kožních lézí - MeLiM prase. Tyto dvě specifické linie miniprasat byly zkříženy a narodila se selata jak s melanomem, tak i transgenní s mutovaným huntingtinem, ale také selata, která byla současně transgenní a měla melanom. Navíc ve stejném vrhu byla i zvířata netransgenní a bez melanomů, která mohou sloužit...
|
|
|
Porcine models for Huntington disease
Růna Vochozková, Petra ; Motlík, Jan (vedoucí práce) ; Bohačiaková, Dáša (oponent) ; Fulková, Helena (oponent)
Kauzální gen huntingtin (HTT) Huntingtonovy choroby byl identifikován před více než 25 lety. Prodloužení CAG opakovaného úseku na více než 39 opakování v exonu 1 jedné HTT alely je dostatečné pro úplnou penetraci této neurodegenerativní choroby. I když identifikace ňkauzální mutace vytvořila naději, že vývoj terapeutických léčiv bude snadno dosažitelný, pacienti a jejich rodiny dosud čekají na léčbu. Hlavním důvodem může být komplexní funkce proteinu HTT v buňce, která stěžuje stanovení konkrétního patologického mechanismu, což se odráží na vývoji léčiv. Přestože bylo dosud vytvořeno mnoho různých zvířecích modelů, žádný z nich plně nekopíruje onemocnění u pacientů. Miniprase se díky své anatomii, fyziologii a genetice zdá být vhodným kandidátem na modely neurodegenerativních nemocí. Ačkoliv transgenní (Tg) miniprasečí Liběchovský model projevuje některé příznaky typické pro HD u pacientů, jako poruchy mužského reprodukčního systému a zvýšené markery neurodegenerace, jsou také pozorovány zjevné nesrovnalosti.Důvodem může být skutečnost, že genetická modifikace je založena na aditivním transgenu kódujícím mutovaný a zkrácený konstrukt cDNA a tudíž neodrážíi četné regulační procesy, od iniciace transkripce až po post- translační modifikace kódovaného proteinu. Lepším odrazem lidské situace jsou...
|
|
|
Modelovanie ochorenia a štúdium regeneračných procesov v Huntingtonovej chorobe a ALS in vivo
Hruška-Plocháň, Marián
Neurologické poruchy postihují více než 14 % světové populace a společně s traumatickým poškozením mozku a míchy představují významnou zdravotní a socioekonomickou zátěž. Výskyt dědičných a idiopatických neurodegenerativních poruch a akutních poškození CNS navíc zaznamenává globální nárůst a neurovědecká komunita je proto stavěna před množství nezodpovězených otázek. To je důvodem, proč lze pokládat výzkum poruch CNS za klíčový. Vzhledem k tomu, že zvířecí modely nemocí a traumatických poškození CNS mají nepostradatelnou úlohu v projekci výsledků základního výzkumu do klinické praxe, tato práce je zaměřena na vytvoření nových zvířecích modelů a jejich využití v preklinickém výzkumu. Vytvořili a charakterizovali jsme transgenní model miniaturního prasete pro Huntingtonovu chorobu, jenž je doposud jediným prasečím modelem a představuje velice hodnotný subjekt pro dlouhodobé testování bezpečnosti léčby. Dále jsme zkřížili již charakterizovaný myší model Huntingtonovy choroby s myším modelem gad postrádajícím expresi UCHL1 s výsledky, které potvrzují teorii o "ochranné" funkci agregátů mutovaného huntingtinu a vedou k předpokladu, že funkce UCHL1 v ubiquitin proteazomového systému mohou být v Huntingtonově chorobě narušené. Traumatické poškození a amyotrofická laterální skleróza (ALS) jsou dvěma...
|
|
|
Porcine models for Huntington disease
Růna Vochozková, Petra ; Motlík, Jan (vedoucí práce) ; Bohačiaková, Dáša (oponent) ; Fulková, Helena (oponent)
Kauzální gen huntingtin (HTT) Huntingtonovy choroby byl identifikován před více než 25 lety. Prodloužení CAG opakovaného úseku na více než 39 opakování v exonu 1 jedné HTT alely je dostatečné pro úplnou penetraci této neurodegenerativní choroby. I když identifikace ňkauzální mutace vytvořila naději, že vývoj terapeutických léčiv bude snadno dosažitelný, pacienti a jejich rodiny dosud čekají na léčbu. Hlavním důvodem může být komplexní funkce proteinu HTT v buňce, která stěžuje stanovení konkrétního patologického mechanismu, což se odráží na vývoji léčiv. Přestože bylo dosud vytvořeno mnoho různých zvířecích modelů, žádný z nich plně nekopíruje onemocnění u pacientů. Miniprase se díky své anatomii, fyziologii a genetice zdá být vhodným kandidátem na modely neurodegenerativních nemocí. Ačkoliv transgenní (Tg) miniprasečí Liběchovský model projevuje některé příznaky typické pro HD u pacientů, jako poruchy mužského reprodukčního systému a zvýšené markery neurodegenerace, jsou také pozorovány zjevné nesrovnalosti.Důvodem může být skutečnost, že genetická modifikace je založena na aditivním transgenu kódujícím mutovaný a zkrácený konstrukt cDNA a tudíž neodrážíi četné regulační procesy, od iniciace transkripce až po post- translační modifikace kódovaného proteinu. Lepším odrazem lidské situace jsou...
|
|
|
Oxidative stress in primary porcine fibroblasts expressing mutated huntingtin
Šmatlíková, Petra ; Askeland, G. ; Vaškovičová, Michaela ; Klíma, Jiří ; Motlík, Jan ; Eide, L. ; Ellederová, Zdeňka
Molecular events, such as protein aggregation, mitochondrial dysfunction, and transcriptional dysregulation have been linked to Huntington’s disease (HD) pathogenesis. Oxidative stress has been considered as one of the key players in disease progression. Though, it is still not clear whether oxidative stress causes HD, or if it is a consequence of other primary events.
|
host ::
RSS.