|
|
Novel substrates of cullin-RING ubiquitin ligases: identification and functional characterisation
Liďák, Tomáš ; Čermák, Lukáš (vedoucí práce) ; Grantz Šašková, Klára (oponent) ; Mašek, Jan (oponent)
Selektivní degradace proteinů ubikvitin-proteazomovým systémem je nezbytná pro udržování buněčné homeostázy a regulaci celé řady biologických procesů. Selektivita tohoto systému je dána stovkami ubikvitin ligáz, které specificky rozeznávají proteiny určené k degradaci (tzv. substráty) a katalyzují jejich ubikvitinaci, čímž je označují pro následnou degradaci. Největší skupinu ubikvitin ligáz tvoří vícepodjednotkové cullin-RING ubikvitin ligázy. Navzdory významnému pokroku v pochopení jejich molekulární architektury, sestavení a regulace zůstávají substráty a funkce většiny z nich neznámé. Tato práce se zabývá dvěma ubikvitin ligázami z podrodiny cullin-RING ubikvitin ligáz 4 (CRL4) - CRL4DCAF4 a CRL4DCAF12 . Za účelem identifikace jejich potenciálních substrátů a určení jejich biologických rolí bylo použito několik odlišných přístupů. S využitím proteomického přístupu jsme identifikovali širokou škálu potenciálních substrátů. Následně byla provedena podrobná charakterizace identifikovaných interakcí a testování podmínek, za kterých potenciální substráty podléhají degradaci. Nakonec byly za účelem odhalení fyziologické role CRL4DCAF4 a CRL4DCAF12 připraveny lidské buněčné linie a myší modely s vyřazeným genem pro DCAF4 a DCAF12. Zde prezentovaná identifikace a validace nových substrátů CRL4DCAF4 a...
|
|
|
Dynamika degradace hodinového proteinu PER2 pomocí detekce bioluminiscence v reálném čase ve tkáňovém explantátu cirkadiánních hodin mPER2Luc myši
Stanislavová, Faustýna ; Sumová, Alena (vedoucí práce) ; Doležel, David (oponent)
Hlavním oscilátorem cirkadiánních rytmů jsou suprachiasmatická jádra. Pomocí hodinových genů a jejich proteinových produktů (tvořících zpětnovazebné transkripčně- translační smyčky) představují významnou roli v řízení mnoha tělesných funkcích. Díky metodě využívající transgenní organismy byla měřena bioluminiscence, potažmo množství hodinového proteinu PER2. V této práci byl využit cykloheximid k inhibici proteosyntézy a k následnému sledování degradace tohoto hodinového proteinu v reálném čase. Protein byl měřen v explantátech suprachiasmatických jader dospělých myší, v suprachiasmatických jádrech fétů a v placentách. Dále byly porovnávány vlivy inhibitorů glykogensyntasykinasy 3b na dynamiku degradace proteinu PER2. Využit byl selektivní inhibitor CHIR-99021 a nespecifický inhibitor chlorid lithný. Z experimentu vyplývá, že inhibitor CHIR degradaci proteinu zpomaluje, a to ve všech použitých tkáních. Oproti tomu vliv nespecifického inhibitoru chloridu lithného nebyl jednoznačně určen. U fetálních jader byl jeho vliv na dynamiku degradace zpomalující, zatímco u dospělých jader byla degradace výrazně zrychlována. U explantátů placent nebyly pozorovány signifikantní výsledky. Výzkumy, zaměřující se na ovlivnění těchto hodinových genů, resp. jejich proteinů, by v budoucnu mohly být využity k...
|
|
|
Protein quality control in the secretory pathway of eukaryotic cells
Bařinková, Markéta ; Stříšovský, Kvido (vedoucí práce) ; Černý, Jan (oponent)
Více než 30 % buněčného proteomu vstupuje během biogeneze do sekreční dráhy v eukaryotických buňkách. Sekreční dráha pak zajišťuje, že jsou tyto proteiny správně složeny, projdou nutnými posttranslačními úpravami a jsou dopraveny ke svému cílovému umístění ať už v membránových organelách, nebo vně buňky. Protože ale značné množství proteinů vstupujících do této dráhy je nefunkční, nebo se nefunkční stane, musí buňka disponovat mechanismy pro kontrolu kvality proteinů, pomocí kterých je z buňky odstraňuje. Jak proteiny putují sekreční dráhou, mohou být degradovány několika způsoby jak v endoplasmatickém retikulu, tak v Golgiho aparátu, endosomech nebo na plasmatické membráně. V těchto drahách je využíváno mnoho molekul od chaperonů, přes ubikvitin ligázy a mnoho dalších. Jsou spojeny sjednocujícím principem, který se nazývá "unfolded protein response" (reakce na nesložené proteiny). Ten tyto dráhy podporuje, pokud jsou přehlcené. Studium mechanismů kontroly kvality proteinů je nutností, neboť nám pomáhá osvětlit vznik značného množství buněčného proteomu. Poruchy v této dráze jsou navíc spojeny s řadou lidských onemocnění od cystické fibrózy po některé neurodegenerativní poruchy. Tyto degradační dráhy jsou zkoumány již několik desetiletí, ale díky posunům v technologii se stále vynořují nové...
|
|
|
Narušení metabolismu proteinů a jeho efekt na růst rostlin
Luklová, Markéta
Studie signálních drah rostlinných hormonů posledních let prokázaly zásadní roli degradace regulačních proteinů těchto drah prostřednictvím ubikvitin-proteazomového systému (UPS). Inhibice tohoto systému má tudíž významný vliv na růst a vývoj rostlin. Tato práce s názvem Narušení metabolismu proteinů a jeho vliv na růst rostlin shrnuje známe informace o mechanismech degradace proteinů proteazomem a blíže rozebírá jeho roli v signální dráze fytohormonu cytokininu. Experimentální část byla rozdělena do dvou částí (i) analýza růstových změn rostlin a (ii) analýzu diurnálních variací semen transgenní linie Arabidopsis RV 86-5, která je nositelkou inducibilního genu pro expresi varianty ubikvitinu zabraňující degradaci zprostředkovanou UPS, pomocí LC-MS profilování. Získané výsledky naznačují, že složitá rovnováha mezi UPS a hladinou cytokininů ovlivňuje cytokininovou signální dráhu a tím i odpověď organismu na jejich působení. Pomocí LC-MS profilování proteomu bylo identifikováno >4,000 proteinů, z nichž 61 bylo na základě předešlých analýz blíže sledováno.
|
|
|
Interakce rostlin s pathogeny: význam proteasomu a cytoskeletu
Zelená, Pavla
Modifikace proteinů ubiquitinem je jeden z regulačních procesů v eukaryotických buňkách a rostliny používají tuto modifikaci při reakci na exogenní a endogenní podněty. Stále více důkazů naznačuje, že ubiquitin- proteasomový systém je klíčový prvek při reakci na biotický stres. Tato práce s názvem Interakce rostlin s patogenem: význam proteasomu a cytoskeletu popisuje úlohu proteasomu v rostlinné signalizaci a stručně shrnuje interakce mezi cytoskeletem a patogenem a nastiňuje roli cytokininů při interakci rostliny s patogenem. V experimentální části byla pomocí několika rozdílných přístupů sledována signalizace proteasomu. Byla sledována růstová odezva, využita metoda pro identifikaci substrátů proteasomu a analyzovány změny cytoskeletu pomocí konfokální mikroskopie. Výsledky ukazují, že použité metody budou užitečné i pro studium interakcí rostlin s patogeny.
|
|
|
Efekt inhibice proteasomu na proteom Arabidopsis thaliana
Dufek, Martin
Proteazom se vyskytuje ve všech eukaryotních organizmech a jeho struktura je vysoce konzervovaná. Hlavní funkcí tohoto multi-proteinového komplexu je usnadnění proteinového obratu a degradace špatně složených, změněných, opotřebených, nebo nepotřebných proteinů. Degradace proteazomem je převážně závislá na kooperaci s komplexním systémem, který konjuguje ubikvitin k proteinům určeným degradaci. Proteazomová dráha je úzce spojena se signálními dráhami fytohormonů a jako taková může hrát významnou roli v růstu a vývoji rostlin. Tato bakalářská práce nazvaná "Efekt inhibice proteazomu na proteom Arabidopsis thaliana" se zabývá ubikvitin-dependentní proteazomovou dráhou se zaměřením na signalizaci fytohromonů. V experimentální části byl pozorován efekt inhibice proteazomu na proteom modelové rostliny Arabidopsis thaliana. Pomocí LC-MS profilování bylo sledováno více jak 1400 proteinů. Statistické zpracování umožnilo nahlédnout do molekulárních mechanizmů odpovědi na proteazomovou inhibici.
|
host ::
RSS.