|
|
The role of CRL4 ubiquitin ligase complex in homeostasis and regeneration of gastro intestinal tract
Daněk, Veronika ; Procházka, Jan (vedoucí práce) ; Janečková, Lucie (oponent) ; Čermák, Lukáš (oponent)
Ubikvitinace představuje důležitý regulační mechanismus ovlivnění funkce proteinů. Aberantní funkce Ub-ligáz je spojena s rozvojem různých patologických stavů. Úplná komplexnost ubikvitinační sítě v homeostáze tkání a karcinogenezi však stále není objasněna, což snižuje potenciál Ub-ligáz stát se terapeutickými cíli. Ve svém doktorském projektu jsem se zaměřila na odhalení role E3 ubikvitinových ligáz, zejména CUL4A, ve změnách regulačních drah, které vedou k poruchám homeostázy trávicího traktu a nádorové expanzi. Pomocí nové techniky sémantického biklastrování jsme provedli profilování exprese E3 ubikvitin ligáz a navrhli dosud nepopsané funkce Ub-ligáz specifických pro trávicí trakt na základě jejich tkáňově specifické exprese a ontologických vztahů. Testování identifikované kompenzační sítě na myším modelu ukázalo, že geny ze stejné ontologické skupiny současně mění svůj expresní vzorec po indukovaném poškození epitelu, což odhaluje jejich pomocnou roli při regeneraci tkáně. Dále jsem se zaměřila na funkci CUL4A jakožto kotvy v rámci komplexu Cullin4-RING E3 ubikvitin ligázy (CRL4). Popsali jsme, že CUL4A je exprimován populacemi sekrečních buněk v tenkém a tlustém střevě. Deficit CUL4A narušuje rovnováhu mezi jednotlivými buněčnými typy podél transverzální struktury střevního epitelu a a vede...
|
|
|
Functional Characterization of SCFFBXO38 Ubiquitin Ligase-dependent Protein Degradation
Dibus, Nikol ; Čermák, Lukáš (vedoucí práce) ; Konvalinka, Jan (oponent) ; D´Angiolella, Vincenzo (oponent)
Ubikvitin ligázy jsou zodpovědné za specifické rozpoznání proteinů určených k odstranění pomocí proteazomu. Cílem našeho projektu byla molekulární a funkční charakterizace ubikvitin ligázy SCFFBXO38 . Podobně jako u mnoha jiných není její biologická funkce dosud podrobně objasněna, přestože se jedná o jedinou ubikvitin ligázu, jejíž mutace vedou k rozvoji distální formy svalové atrofie. V první části našeho projektu jsme identifikovali nové substráty této ubikvitin ligázy, a to jaderné proteiny ZXDA a ZXDB, jejichž funkce není dosud popsána. Pomocí genetických a biochemických metod jsme prokázali, že proteiny ZXDA/B jsou pozitivními regulátory integrity centromerického chromatinu, a že experimentální inaktivace ubikvitin ligázy SCFFBXO38 vede ke stabilizaci proteinů CENP-A a CENP-B v oblasti centromer, a to v závislosti na ZXDA/B. Ve druhé části projektu jsme se zaměřili na analýzu myšího modelu s delecí genu Fbxo38. Prokázali jsme, že ztráta Fbxo38 vede k poruchám růstu, které postihují různé orgány včetně samčí reprodukční soustavy. Podrobnou histologickou analýzou jsme odhalili patologické změny v semenotvorných kanálcích doprovázené nižší produkcí spermií a sníženou fertilitou. Dále jsme ukázali, že FBXO38 je funkčně exprimována v Sertoliho buňkách, které jsou nezbytným regulátorem...
|
|
|
Ubiquitin-proteasome system in studies of its inhibition and its utilization in the cell-based assay measuring viral protease activity
Fürst, Eliška ; Majerová, Taťána (vedoucí práce) ; Čermák, Lukáš (oponent)
a klíčová slova Abstrakt a klíčová slova Ubikvitin-proteazomální systém (UPS) je specificky regulovaná dráha degradace proteinů. Inhibice komponentů UPS může představovat budoucnost léčení lidských nemocí, zejména rakoviny. Modulace UPS však může být i užitečným nástrojem základního výzkumu. Práce se zabývá dvěma nezávislými, avšak metodologicky propojenými, výzkumnými cíli - prvním cílem je hledání substrátu UPS inhibitoru CBU79 a druhým cílem je vývoj buněčného reportérového systému pro sledování aktivity proteáz založený na proteinové degradaci. V první části práce jsme potvrdili dřívější poznatky mechanismu inhibice UPS. Dále jsme pomocí metabolického značení proteinů založeného na click chemii zkoumali, jak UPS inhibitor CBU79 ovlivňuje syntézu proteinů. Analyzovali jsme též cytotoxicitu inhibitoru CBU79 na různých buněčných liniích. Nakonec jsme provedli celogenomové testování pomocí technologie CRISPR/Cas9 s cílem nalezení substrátu tohoto inhibitoru. Zjistili jsme, že inhibitor CBU79 negativně ovlivňuje syntézu proteinů pravděpodobně přes signalizaci buněčné odpovědi na špatně sbalené proteiny. Pomocí tohoto testování jsme nalezli 22 možných cílů inhibitoru, které budou ověřeny v dalších pracích. Ve druhé části práce jsme využili znalosti UPS k navržení neinfekční reportérové buněčné eseje,...
|
|
|
Roles of acrosomal proteins in fertilization
Macíčková, Eliška ; Stopka, Pavel (vedoucí práce) ; Čermák, Lukáš (oponent)
Akrozom je klíčovou organelou pro spermii. Poruchy v jeho biogenezi vedou často k defektnímu vývoji spermie a neschopnosti úspěšně oplodnit vajíčko. Ačkoli je zřejmé, že akrozom je pro spermii důležitý, stále není vyřešeno v čem spočívá jeho hlavní funkce. Prvotní hypotéza zněla, že akrozom je důležitý pro průchod extracelulárními obaly vajíčka. K této teorii přispívá také fakt, že je akrozom plný proteolytických enzymů a inhibice těchto enzymů, vede ke snížené schopnosti fertilizace. Nicméně tato hypotéza začala být zpochybňována, když bylo zjištěno, (i) že spermie po akrozomální reakci, je stále schopna projít extracelulárními obaly a oplodnit vajíčko (ii) že většina spermií dorazí k vajíčku už bez akrozomálního váčku. Proto jsme si v této práci kladli za cíl charakterizovat proteom akrozomu a spermii po akrozomální reakci, identifikovat důležité proteiny pomocí pokročilých bioinformatických přístupů a diskutovat roli akrozomu, jako váčku, který slouží pro uskladnění a degradaci metabolitů, po předešlém procesu zrání. Přinesli jsme tak nové poznatky, které přispívají k hypotéze, že akrozom je organela příbuzná lysozomu. Klíčová slova: spermie, akrozom, nLC-MS/MS, random forest, Lipokaliny, lysosomu- příbuzná organela
|
|
|
Novel substrates of cullin-RING ubiquitin ligases: identification and functional characterisation
Liďák, Tomáš ; Čermák, Lukáš (vedoucí práce) ; Grantz Šašková, Klára (oponent) ; Mašek, Jan (oponent)
Selektivní degradace proteinů ubikvitin-proteazomovým systémem je nezbytná pro udržování buněčné homeostázy a regulaci celé řady biologických procesů. Selektivita tohoto systému je dána stovkami ubikvitin ligáz, které specificky rozeznávají proteiny určené k degradaci (tzv. substráty) a katalyzují jejich ubikvitinaci, čímž je označují pro následnou degradaci. Největší skupinu ubikvitin ligáz tvoří vícepodjednotkové cullin-RING ubikvitin ligázy. Navzdory významnému pokroku v pochopení jejich molekulární architektury, sestavení a regulace zůstávají substráty a funkce většiny z nich neznámé. Tato práce se zabývá dvěma ubikvitin ligázami z podrodiny cullin-RING ubikvitin ligáz 4 (CRL4) - CRL4DCAF4 a CRL4DCAF12 . Za účelem identifikace jejich potenciálních substrátů a určení jejich biologických rolí bylo použito několik odlišných přístupů. S využitím proteomického přístupu jsme identifikovali širokou škálu potenciálních substrátů. Následně byla provedena podrobná charakterizace identifikovaných interakcí a testování podmínek, za kterých potenciální substráty podléhají degradaci. Nakonec byly za účelem odhalení fyziologické role CRL4DCAF4 a CRL4DCAF12 připraveny lidské buněčné linie a myší modely s vyřazeným genem pro DCAF4 a DCAF12. Zde prezentovaná identifikace a validace nových substrátů CRL4DCAF4 a...
|
|
|
Defects in DNA repair and RNA metabolism associated with human neurological disorders
Cihlářová, Zuzana ; Hanzlíková, Hana (vedoucí práce) ; Čermák, Lukáš (oponent) ; Roithová, Adriana (oponent)
Lidský genom neustále podléhá vlivům vnějšího a vnitřního prostředí, které přímo či nepřímo poškozují DNA a mohou dále narušovat buněčné procesy, mimo jiné i metabolismus RNA. Buňky však disponují řadou mechanismů, jak tato DNA poškození rychle opravit, což zdůrazňuje význam integrity a stability genomu. Chybná oprava DNA a poruchy v metabolism RNA mohou vést k degeneraci neuronů, predispozici k rakovině a zvýšenému výskytu dědičných genetických onemocnění. Mutace v proteinu BRAT1 (s BRCA1 asociovaný ATM aktivátor-1) způsobují neurologická onemocnění, která se projevují různě závažnými klinickými fenotypy. Tato heterogenita sahá od těžkého průběhu, který se projevuje mikrocefalií, hypertonií, epilepsií, záchvaty a brzkým úmrtím jedince, zpravidla do dvou let od narození. Naopak mírnější forma BRAT1-asociovaného onemocnění je charakterizována převážně cerebelární atrofií a ataxií. Některé studie naznačují možnou úlohu proteinu BRAT1 během oprav dvojřetězcových zlomů DNA, a to zejména prostřednictvím jeho účasti při aktivaci ATM kinázy. Dosud však není jasné, jakým způsobem mutace v genu BRAT1 přispívá k degeneraci neuronů. V rámci tohoto projektu jsme se tudíž zaměřili na studium role BRAT1 v buňkách pacientů, kteří vykazují degeneraci neuronů způsobenou homozygotní missense c.185T>A (p.Val62Glu)...
|
|
|
Role of RAD18 in ubiquitin signaling at DNA double-strand breaks
Palek, Matouš ; Macůrek, Libor (vedoucí práce) ; Čermák, Lukáš (oponent)
RAD18 je E3 ubikvitin ligáza, která se podílí na ochraně replikační vidličky před kolapsem způsobeným poškozenou DNA. Narušená funkce tohoto důležitého faktoru regulujícího replikaci byla popsána v souvislosti s některými lidskými nádory. Klinická relevance těchto zjištění však není známá. Cílem této práce bylo zhodnocení vybraných RAD18 variant nalezených u pacientů s nádory prsu a ovarií. Její výsledku ukazují, že RAD18 varianty vykazují defekty nejen v ochraně replikační vidličky, ale i v opravě dvouřetězcových zlomů. U této nekonvenční role RAD18 se ví, že je závislá na činnosti dalších ubikvitin ligáz, jak ale přispívá k samotné opravě zůstává záhadou. Dalším cílem této práce proto bylo osvětlení funkce RAD18 v opravě dvouřetězcových DNA zlomů homologní rekombinací s důrazem na jeho vztah s 53BP1. Výsledná data ukazují, že RAD18 kompetuje s 53BP1 o stejné vazebné místo a efektivně brání jeho akumulaci na poškozenou DNA, čímž podporuje resekci DNA. Tato antagonistická funkce RAD18 je vymezená jak prostorově (do okolí opravného centra) tak i časově (do S fáze). Navíc se zdá, že je regulovaná existencí dvou RAD18 komplexů. Potenciální modely vysvětlující tuto regulaci jsou diskutovány na konci této práce. Klíčová slova: RAD18, oprava dvouřetězcových zlomů, ubikvitinace, nádorové varianty, resekce...
|
|
|
Role ubikvitin ligázy Fbxo38 v myší spermatogenezi
Zobalová, Eliška ; Čermák, Lukáš (vedoucí práce) ; Stopka, Pavel (oponent)
Ubikvitin ligázy závislé na cullinových podjednotkách jsou zodpovědné za regulaci většiny buněčných procesů. Navzdory tomu, že jejich mutované formy jsou příčinou vzniku mnoha lidských onemocnění, nejsou jejich fyziologické role dostatečně popsány. V rámci předkládaných výsledků jsme se soustředili na fyziologickou roli ubikvitin ligázy SCFFBXO38 (SKP1-CULLIN1-FBXO38), jejíž mutované formy jsou zodpovědné za progresi distální neuropatie. Příprava myšího modelu absence FBXO38 odhalila vyšší mortalitu homozygotních mláďat a růstový defekt, a to jak na úrovni celého organismu, tak i jednotlivých orgánů, zejména jater a varlat. Samci s delecí v genu Fbxo38 měli výrazně nižší reprodukční schopnost, což souviselo s nižší produkcí maturovaných spermií a patologickými změnami ve struktuře semenotvorných tubulů. Zjistili jsme, že protein FBXO38 je funkčně exprimován v Sertoliho buňkách zodpovědných za regulaci spermatogeneze a integrity semenotvorných kanálků. Bližší analýza spermatogenních populací odhalila defekt na úrovni spermatocytární diferenciace. Dynamika této diferenciace je závislá na funkční integritě hematotestikulární bariéry tvořené mezibuněčnými spoji Sertoliho buněk. Potvrdili jsme, že retenční schopnost této bariéry byla u mutovaných zvířat snížena, což korelovalo s poklesem exprese její...
|
|
|
BIOPHYSICAL AND FUNCTIONAL CHARACTERIZATION OF DDI1-LIKE ASPARTIC PROTEASES INVOLVED IN REPLICATION STRESS RESPONSE
Svoboda, Michal ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent) ; Čermák, Lukáš (oponent)
Bezchybná a včasná replikace molekul DNA je jedním z rozhodujících momentů životního cyklu každého organismu. Jakýkoliv defekt, ať už v časování či lokalizaci, může tento delikátní, na přesnosti závislý mechanismus uvrhnout do stavu takzvaného replikačního stresu. Některé z překážek blokujících postup replikační vidličky obsahují proteinovou složku. V průběhu evoluce se tak vyvinuly specializované proteasy, zodpovědné právě za uvolňování replikačního stresu. Kompletní paleta těchto proteolytických enzymů, stejně jako jejich substrátový repertoár a detailní molekulární mechanismus jejich zapojení v obraně proti DNA replikačnímu stresu však dosud nebyly objasněny. Tato disertační práce se zabývá rolí evolučně konzervovaných aspartátových proteas z rodiny proteinů podobných Ddi1 v proteolytické odpovědi na DNA replikační stres. V této práci byly strukturně a biofyzikálně charakterisováni členové rodiny Ddi1 podobných proteinů kvasinkového a lidského původu, byly prozkoumány jejich interakce s ubikvitinem, stejně jako s polyubikvitinovými řetězci. V neposlední řadě byla též mutantního kvasinkového kmene, který vedle genu pro DDI1 postrádá také gen pro DNA aktivovanou metalloproteasu WSS1, identifikována přecitlivělost na hydroxymočovinu, známý inhibitor replikace DNA. Detailní rozbor role kvasinkové...
|
|
|
Ubiquitin-proteasome system in studies of its inhibition and its utilization in the cell-based assay measuring viral protease activity
Fürst, Eliška ; Majerová, Taťána (vedoucí práce) ; Čermák, Lukáš (oponent)
a klíčová slova Abstrakt a klíčová slova Ubikvitin-proteazomální systém (UPS) je specificky regulovaná dráha degradace proteinů. Inhibice komponentů UPS může představovat budoucnost léčení lidských nemocí, zejména rakoviny. Modulace UPS však může být i užitečným nástrojem základního výzkumu. Práce se zabývá dvěma nezávislými, avšak metodologicky propojenými, výzkumnými cíli - prvním cílem je hledání substrátu UPS inhibitoru CBU79 a druhým cílem je vývoj buněčného reportérového systému pro sledování aktivity proteáz založený na proteinové degradaci. V první části práce jsme potvrdili dřívější poznatky mechanismu inhibice UPS. Dále jsme pomocí metabolického značení proteinů založeného na click chemii zkoumali, jak UPS inhibitor CBU79 ovlivňuje syntézu proteinů. Analyzovali jsme též cytotoxicitu inhibitoru CBU79 na různých buněčných liniích. Nakonec jsme provedli celogenomové testování pomocí technologie CRISPR/Cas9 s cílem nalezení substrátu tohoto inhibitoru. Zjistili jsme, že inhibitor CBU79 negativně ovlivňuje syntézu proteinů pravděpodobně přes signalizaci buněčné odpovědi na špatně sbalené proteiny. Pomocí tohoto testování jsme nalezli 22 možných cílů inhibitoru, které budou ověřeny v dalších pracích. Ve druhé části práce jsme využili znalosti UPS k navržení neinfekční reportérové buněčné eseje,...
|
host ::
RSS.