|
|
Využití metody RT-PCR při studiu reakce rostlin řepky na stres chladem
MANDÁK, Michal
Přestože podíl řepky olejky (Brassica napus) vůči ostatním olejnatým plodinám na světovém trhu neustále stoupá, její potenciál pro kultivaci je, tak jako u řady dalších plodin, stále omezený kvůli její citlivosti na abiotický stres chladem. Teoretická část této práce se proto zabývá problematikou rostlinného stresu a popisem metody RT-qPCR v kontextu vhodnosti jejího užití pro kvantifikaci změn ke kterým během chladového stresu dochází. V praktické části byla provedena analýza genové exprese u vybraného dehydrinového genu ERD10 včetně popisu odebírání vzorků z rostlin, způsob izolace RNA, reverzní transkripce do cDNA a vlastní RT-qPCR. Výzkumný soubor tvořili dvě odrůdy řepky Cadeli a Navajo podrobené stresu chladem při (2°)C. Původním předpokladem bylo, že mezi těmito odrůdami bude znatelný rozdíl v úrovni exprese ERD10 genu v závislosti na schopnosti těchto rostlin odolávat stresu chladem. Interpretace dat pak i přes jejich neúplnost tuto původní domněnku potvrdila. V průběhu prvních 6ti dní stresu chladem docházelo u odrůdy Navajo k znatelně vyšší expresi oproti odrůdě Cadeli. Na základě souvislosti mezi expresí ERD10 a odolností vůči chladu by mělo být možné použít ERD10 jako jeden z markerů k selekci chladu odolných genotypů.
|
|
|
Analýza genů indukovaných abiotickým stresem u řepky
HOŠTIČKOVÁ, Irena
Šlechtění na odolnost vůči abiotickým stresorům je v současné době jedním z nosných témat šlechtění rostlin. Ve šlechtitelských programech řepky byla v případě selekce rostlin s vyšší odolností abiotickým stresům pozornost po dlouhé období věnována převážně jen popisným morfologickým a fyziologickým parametrům. V rámci této dizertační práce bylo provedeno několik experimentů zaměřených na identifikaci potenciálních genů spojených s reakcí na abiotický stres pomocí metody RT-qPCR (quantitative reverse transcription PCR). Zároveň byla použita metoda SPR (rezonance povrchového plazmonu), moderní optická metoda, která umožňuje studovat velmi nízké koncentrace nativních proteinů i v přítomnosti jiných látek, umožňuje kvantifikaci konkrétních proteinů vazbou na specifické protilátky a u řepky či jiných významných plodin nebyla doposud použita. Protein ERD10 byl pomocí metody rezonance povrchového plazmonu (SPR) identifikován jako protein účastnící se reakce na stres chladem, resp. aklimatizaci. Z výsledků vyplývá, že akumulace proteinu ERD10 ve standartních podmínkách ovlivňuje dynamiku změny jeho akumulace v průběhu stresu chladem. V případě, že hledáme genotypy, které by měly vynikat svou schopností aklimatizovat se i během krátkého teplého podzimu, nabízí se analýza akumulace dehydrinů metodou rezonance povrchového plazmonu jako vhodná metoda pro rychlý, nenáročný a relativně levný skrínink většího množství genotypů ve šlechtitelských kolekcích. Dalšími testovanými geny byly LTI78, RCI2A, NRP1 a dva geny pro hypotetické proteiny. Jejich relativní exprese se v průběhu stresu chladem také výrazně zvyšovala. O funkci těchto genů a proteinů se toho zatím ví velmi málo, proto budou jistě zajímavým předmětem dalších experimentů. Dále byla testována také relativní exprese genů vytipovaných podle výsledků analýzy proteinů metodou MALDI-TOF/TOF u regenerovaných mikrosporových embryí odvozených z rostlin řepky stresovaných simulovaným suchem. Byly testovány geny pro lactoylglutathione lyázu I, fosfolipázu D 1 a peroxiredoxin antioxidázu. U odolnější odrůdy ve standardních podmínkách a na začátku stresu byla naměřena významně nižší exprese genu pro peroxiredoxin antioxidázu. Tento gen bude předmětem našeho dalšího zkoumání jako potenciální marker pro výběr genotypů, které mohou být odolnější stresu suchem.
|
|
|
Glutamate receptors in NG2-glial cells: gene profiling and functional changes after ischemic brain injury
Waloschková, Eliška ; Anděrová, Miroslava (vedoucí práce) ; Růžička, Jiří (oponent)
Glutamát je hlavním excitačním neuropřenašečem v mozku savců a jeho přenos je zodpovědný za vyšší mozkové funkce, jako jsou učení, pamět či kognice. Účinek glutamátu je zprostředkován různými typy glutamátových receptorů, jejichž vlastnosti byly doposud studovány převážně v neuronech. Glutamátové receptory jsou ovšem exprimovány také v NG2 gliových buňkách, nicméně jejich role, jak ve zdravém tak i v poškozeném mozku, není zcela známá. Cílem této práce bylo objasnit složení a funkce těchto receptorů u NG2 gliových buněk za fyziologických podmínek a po fokální cerebrální ischemii. K tomuto účelu jsme použili transgenní myši, ve kterých jsou NG2 gliové buňky značeny pomocí fluorescenčního proteinu, což nám umožnilo jejich přesnou identifikaci. Analýza expresního profilu glutamátových receptorů v NG2 gliových buňkách byla provedena pomocí metody RT-qPCR na úrovni jedné buňky. Dále byla použita imunohistochemie a fluorescenční metoda zobrazování intracelulárních hladin vápenatých iontů (calcium imaging) pro detekci glutamátových receptorů na úrovni proteinu a charakterizaci jejich funkčních vlastností.
|
|
|
Metodika detekce virů obilnin a trav pomocí SYBR Green I RT-qPCR
Jarošová, Jana ; Dráb, Tomáš ; Beoni, Eva ; Kumar, Jiban
Čeleď Poaceae je zemědělsky nejdůležitější čeledí rostlin na světě. Čeleď Poaceae je také hostitelem mnoha patogenů včetně více než sta známých druhů virů. Rozložení výskytu jednotlivých druhů virů se liší v závislosti na hostitelích, zeměpisných a jiných podmínkách. Tato metodika poskytuje popis způsobu detekce devíti virů obilnin a trav: virus mozaiky sveřepu (BMV), virus žluté zakrslosti ječmene (BYDV), latentní virus jílku (LoLV), virus nekrotické mozaiky ovsa (ONMV), virus mozaiky jílku (RgMV), půdou přenosný virus mozaiky obilnin (SBCMV), virus skvrnitosti spartiny (SpMV), virus zakrsalosti pšenice (WDV), a virus čárkovité mozaiky pšenice (WSMV) pomocí metody SYBR Green I RT-qPCR.
Plný text:  PDF
|
|
|
Single cell expression analysis of genes with potential mrna gradient in mouse oocytes
Dorosh, Andriy ; Margaryan, Hasmik ; Vodička, Martin ; Ergang, Peter ; Šídová, Monika ; Dvořáková-Hortová, Kateřina
In frogs, there are clearly visible differently pigmented animal and vegetal poles of the egg determined before fertilization and leading to asymmetrical divisions. Mammalian egg does not show any comparable differentiation and it has been generally accepted that even the individual blastomeres in 2-cell and 4-cell embryos are homogenous. However, recent findings suggest that those blastomeres display different gene expression patterns and might already possess some inclinations to specific cell lineages. We therefore raised a question, whether there could be any mRNA or protein gradients in pre-fertilization oocytes similar to a previously described amphibian egg one. In mammalian eggs, there is a membrane region that is poor in microvilli, cortical granules are absent beneath plasma membrane and sperm cells generally do not bind to this location. This microvilli free region also covers the egg nucleus, and cytoskeleton localization differs markedly to the rest of the cortical space, forming actin –myosin II cortical cap/ring and is considered as animal pole. The purpose of this study was to determine gene products that can be detected at single cell level using qPCR and display gradient like distribution in mature oocytes. We checked expression of 12 selected genes in a pool of 10 oocytes and single mature oocytes. Then, we analysed gene expression in fixed intact oocytes and those undergoing laser capture microdissection procedure (LCMD). Eventually, we have determined six candidate genes for the study of intracellular spatial gene expression in mature mammalian oocytes by subcellular qPCR and in situ hybridization.
|
|
|
Estrogen receptor beta (ERβ) in testicular cells and sperm
Dostálová, Pavla ; Žatecká, Eva ; Děd, Lukáš ; Dorosh, Andriy ; Postlerová, Pavla ; Jonáková, Věra ; Dvořáková-Hortová, Kateřina ; Pěknicová, Jana
Estrogen is a steroid hormone that plays an important role during sperm development in the male and female reproductive tract. Estrogen signalling is a complex process that depends on cell milieu and presence of receptors. Thanks to the steroid nature of estrogens, they can pass through the plasmatic membrane and bind to the intracellular estrogen receptors (ERs). Within the cell, there are several pools of ERs. One of them is localized to the cell nucleus and their activation leads to direct or indirect binding to DNA and ultimately to alternation in gene expression (genomic pathway). Other pools of ERs are associated with plasma membrane or are located in cytosol. Activation of membrane associated ERs leads to rapid non-genomic responses. Nowadays, two classical estrogen receptors are known – ERα and ERβ. Since ERβ is a predominant variant in testes, we focused our study on expression of ERβ variants in murine testes and sperm. We detected two variants of ERβ at mRNA level in both, testes and sperm. These variants differ in 54 nucleotids within the ligand binding domain and this variability results in different affinity to estrogen. We analyzed individual testicular cell types (spermatogonia, spermatocytes, spermatids, Sertoli cells) by RT-qPCR. Our results suggest that both ERβ variants are coexpressed in the same cell type and may therefore interact together. This may have consequences in mediating of estrogen signalling. Moreover, ERβ is expressed more in the later stages of spermatogenesis suggesting the role of ERβ in these stages or alternatively in spermatozoa alone. At the protein level, we detected ERβ in nuclear, membrane and cytosolic fraction prepared from testicular tissue suggesting the involvement of both, genomic and non-genomic, pathways of estrogen signaling in testes. In sperm, anti-ERβ antibodies localized ERβ in acrosome region and tail which is in accordance with the known role of estrogen on capacitation, acrosome reaction and motility.
|
host ::
RSS.