|
|
Multidisciplinární charakterizace interakcí mezi estrogenními hormony a jejich receptory při kapacitaci spermií.
Bosáková, Tereza ; Komrsková, Kateřina (vedoucí práce) ; Smrček, Stanislav (oponent) ; Postlerová, Pavla (oponent)
Tato disertační práce byla zaměřena na multidisciplinární charakterizaci interakcí mezi hormony a jejich receptory při kapacitaci spermií, která je finálním krokem maturace spermií u savců a je k oplození vajíčka klíčová. Pro studium byly vybrány tři estrogenní hormony (17β- estradiol (E2), 17α-estradiol (αE2), 17α-ethynylestradiol (EE2)), které jsou součástí znečištění životního prostředí. Tyto hormony, jsou nazývané jako endokrinní disruptory, neboť mohou vyvolat u živočichů poruchy hormonálního systému, a tím negativně ovlivnit fyziologické procesy včetně reprodukce. Nově vyvinutou analytickou HPLC-MS/MS metodou byly sledovány koncentrační změny daných estrogenů (E2, αE2 a EE2) během časově závislé kapacitace myších, resp. potkaních, spermií in vitro. Pro jednotlivé estrogeny byly definovány závislosti koncentrace volného, na spermie nevázaného hormonu na čase kapacitace pro tři vsádkové koncentrace jednotlivých hormonů (200, 20 a 2 μg/L). Získané koncentrační hodnoty byly převedeny na hodnoty relativních koncentrací, které byly podrobeny kinetické analýze. Pro interakci jednotlivých hormonů se spermiemi byly navrženy kinetické modely, které byly popsány systémem diferenciálních rovnic s optimalizací rychlostních konstant a molárního poměru. Optimalizace probíhala na základě hledání minima...
|
|
|
Vliv morfologické variability spermií na složení proteomu myšovitých hlodavců
Drozdová, Tereza ; Stopka, Pavel (vedoucí práce) ; Postlerová, Pavla (oponent)
Mezi spermiemi různých druhů živočichů nacházíme celou škálu morfologických rozdílů, ať už na úrovni tvaru, velikosti, či intracelulárního uspořádání. Je prokázáno, že tyto rozdíly mohou být způsobeny selekčním tlakem způsobeným kompeticí spermií. Tím vznikají morfologické adaptace, které dávají spermiím selekční výhodu a zvyšují tak úspěšnost jedince při oplození. Hlavním cílem mé diplomové práce bylo zjistit, zda je individuální morfologická variabilita spermií detekovatelná na úrovni proteomu a případně určit, jaké změny na úrovni proteomu probíhají ve spermiích s měnící se morfologií. Pro tento výzkum byly vybrány tři druhy myšovitých hlodavců, Mus musculus, Apodemus flavicollis a Microtus arvalis, u nichž bylo provedeno důkladné morfometrické měření spermií. Vzhledem k tomu, že byla největší variabilita detekována v rozměrech apikálního háčku, byly analyzovány pouze akrozomální proteiny pomocí hmotnostní spektrometrie, a následně byly pomocí diskriminační analýzy a metod strojového učení určeny proteiny, které nejvíce odlišují spermie s dlouhým a krátkým apikálním háčkem. Signifikantní trend mezi proteiny odlišující spermie s krátkým a dlouhým apikálním háčkem, bez ohledu na druh, byl identifikován u proteinů účastnících se převážně metabolismu sacharidů a výroby energie. Jedná se mimo jiné o...
|
|
|
Protein Rab-2A: jeho lokalizace a funkce v lidských spermiích a fertilizaci
Sadílková, Lucie ; Postlerová, Pavla (vedoucí práce) ; Lánská, Eva (oponent)
Protein Rab-2A patří do Rab rodiny monomerních G-proteinů podílejících se na regulaci intracelulárního vezikulárního transportu. Přestože bylo publikováno několik studií popisující roli proteinu Rab-2A v savčích spermiích, přesná lokalizace ani funkce tohoto proteinu v samčích gametách nebyly dosud plně pochopeny. V předkládané diplomové práci jsme za využití protilátky 5C5, vytvořené Laboratoří reprodukční biologie, jako první popsali přítomnost Rab-2A v lidských spermiích. Protilátkou 5C5 se nám v lyzátu lidských spermií podařilo identifikovat několik izoforem Rab-2A o molekulových hmotnostech 26, 24, 22 a 18 kDa, jejichž identita byla potvrzena analýzou hmotnostní spektrometrie. Rab-2A jsme pomocí metody nepřímé imunofluorescence lokalizovali v oblasti akrozomu ejakulovaných i kapacitovaných spermií, odkud protein v průběhu akrozomální reakce odchází. Dále jsme zjistili sníženou hladinu proteinu Rab-2A u spermií od pacientů s různými patologiemi ejakulátu. Na základě studií popisující roli Rab-2A v biogenezi akrozomu a přítomnost Rab-2A v perinukleární théce býčích spermií, jsme se pokusili o detekci Rab-2A v této proteinové vrstvě také u lidských spermií. Zvolená metoda však zřejmě není využitelná pro lidské spermie a izolace se nezdařila. Dále jsme prokázali přítomnost Rab-2A v sekrečních...
|
|
|
Studium proteinů spermií různých savčích druhů
Pohlová, Alžběta ; Postlerová, Pavla (vedoucí práce) ; Ryšlavá, Helena (oponent)
Rozmnožování je základní charakteristikou všech zvířat a nezbytným krokem k produkci nové generace. Studium proteinů spermií je rozhodující pro pochopení vzájemného rozpoznání spermie a vajíčka. Zabývali jsme se povrchovými proteiny, které se podílejí na vazbě na zona pellucida a zkoumali, zda jsou tyto proteiny zachovány v rámci savčích druhů. Nepřímá imunofluorescenční mikroskopie byla použita k testování panelu monoklonálních protilátek, které byly připraveny proti povrchovým proteinům spermií prasete, na býčích a myších spermiích. Byla nalezena zkřížená mezidruhová reaktivita některých protilátek proti kančím spermiím na ejakulovaných spermiích býka a na epididymálních spermiích myši. Dále jsme izolovali proteiny spermií různých savčích druhů: prasete, býka, psa, kocoura, myši a člověka. Proteiny byly separovány elektroforeticky v přítomnosti SDS a byly porovnány proteinové a glykoproteinové profily epididymálních, ejakulovaných a in vitro kapacitovaných spermií. Interakce spermií se zona pellucida byly studovány na elektroforeticky separovaných povrchových proteinech spermií prasete a býka reakcí s biotinem- značenými glykoproteiny zona pellucida. Protilátky značící povrchové proteiny kančích spermií se zona pellucida vázající aktivitou byly použity ke sledování původu daného proteinu v...
|
|
|
Isolation and study of proteins with zona pellucida binding activity
Zigo, Michal ; Postlerová, Pavla (vedoucí práce) ; Ryšlavá, Helena (oponent) ; Antalíková, Jana (oponent)
Vazba spermie na vajíčko je zprostředkována komplementárními molekulami na povrchu obou gamet a zahrnuje interakci proteinových receptorů spermie se sacharidovými strukturami zona pellucida (ZP). Ukázalo se, že do interakce spermie se ZP je zapojeno mnoho proteinových receptorů a potenciální primární receptory spermie pro vazbu na glykoproteiny ZP byly zkoumány u různých savců. Většina proteinů spermie, u kterých byla zjištěna vazebná aktivita se ZP, patří k proteinům plazmatické membrány. Nicméně přesné metody pro izolaci membránových proteinů spermie nejsou doposud standardizovány. Tato práce je zaměřena na využití různých izolačních protokolů, které vedou k získání extraktů odlišného proteinového složení. Dále jsou zahrnuty dva možné přístupy pro odhalení nových potenciálních vazebných receptorů spermií pro primární vazbu se ZP a jejich identifikace. Proteiny z ejakulovaných a in vitro kapacitovaných kančích spermií byly izolovány za použití různých extrakčních postupů: Triton X-100, Triton X-114, kyselina octová, dodecylsulfát sodný (SDS), N-oktyl-β-D-glukopyranosid (OBG), rehydratační pufr (RHB) a nakonec extrakcí pomocí zmrazení a následného tání. Tyto proteinové extrakty byly charakterizovány pomocí 1-D a 2-D proteinových profilů, barvením na glykoproteiny a substrátovými zymografickými...
|
|
|
Studium proteinů sekretovaných samčím reprodukčním traktem
Cozlová, Nina ; Postlerová, Pavla (vedoucí práce) ; Železná, Blanka (oponent) ; Antalíková, Jana (oponent)
1 AbstraktAbstraktAbstraktAbstrakt Proteiny sekretované samčím reprodukčním traktem hrají významnou roli v post- testikulárním vývoji spermie a v následných krocích reprodukčního procesu vedoucích k oplození. Epididymální maturace spermií je klíčovou událostí reprodukčního procesu. Spermie procházející epididymem prodělává významné změny působením proteolytických enzymů a glykosidas. Proteinasy a jejich inhibitory hrají důležitou roli téměř ve všech fyziologických procesech a jsou přítomny ve všech tkáních a tělních tekutinách. Inhibitor akrosinu (AI) chrání spermie a epitel reprodukčního traktu před nežádoucí proteolytickou degradací a vazebná místa pro zona pellucida (ZP) na plasmatické membráně spermie. Z kančího reprodukčního traktu byl izolován AI ze semenné plasmy a z povrchu spermie. Pomocí polyklonální protilátky jsme detekovali AI v extraktech z cauda epididymis, semenných vaků, prostaty, Cowperových žláz. Imunofluorescenční technikou jsme vizualizovali AI v epitelu i lumen orgánu a na povrchu epididymálních a ejakulovaných spermií a byl nalezen narůstající signál pro AI podél epididymu. Genová exprese mRNA pro AI byla pozitivní v epididymu, semenných vacích, prostatě, Cowperových žlázách a signál vzrůstal i podél epididymu. AI byl detekován také v epididymální tekutině a na spermiích podél...
|
|
|
Využití transkriptomiky při studiu mechanismu působení komplexních směsí organických látek ve vnějším ovzduší se zaměřením na polycyklické aromatické uhlovodíky
Líbalová, Helena ; Topinka, Jan (vedoucí práce) ; Krásný, Libor (oponent) ; Postlerová, Pavla (oponent)
Polycyklické aromatické uhlovodíky (PAU) tvoří rozsáhlou skupinu organických sloučenin vyskytujících se jako polutanty ve vnějším ovzduší. Kromě genotoxických účinků působí některé z nich jako kompletní karcinogeny, tzn. mají také negenotoxické a nádorově promoční vlastnosti. Ačkoli jsou účinky mnoha individuálních PAU dobře popsány, k expozici člověka ve vnějším prostředí dochází především působením komplexních směsí obsahujících PAU a pouze několik málo prací se věnuje problematice působení těchto reálných komplexních směsí. První část dizertační práce se zabývá změnami globální genové exprese v lidských embryonálních plicních fibroblastech po působení komplexních směsí obsahujících PAU extrahovaných z respirabilních prachových částic PM2.5 v ovzduší. Částice byly odebrány ve 4 lokalitách České republiky (Ostrava - Bartovice, Ostrava - Poruba, Karviná a Třeboň), které se liší mírou i zdroji znečištění ovzduší. Pro stanovení změn genové exprese jsme analyzovali buňky inkubované 24h se 3 subtoxickými koncentracemi organických extraktů částic z ovzduší (EOM) z každé lokality pomocí čipové technologie. Pro hlubší interpretaci dat jsme použili analýzu signálních drah s využitím databáze Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). V každé lokalitě jsme identifikovali deregulované signální dráhy a...
|
|
|
Izolace a charakterizace proteinů oviduktu podílejících se na tvorbě oviduktálního rezervoáru spermií u skotu
Kračmerová, Jana ; Liberda, Jiří (vedoucí práce) ; Postlerová, Pavla (oponent)
Tvorba oviduktálního rezervoáru spermií hraje důležitou roli v procesu fertilizace savčího vajíčka. Izolace a charakterizace některých komponent hovězího oviduktu účastnících se interakce spermií s povrchovými složkami oviduktu byla předmětem této studie. Byly připraveny dva afinitní nosiče obsahující imobilizované proteinové složky býčí semenné plasmy: jednak neseparované proteiny býčí semenné plasmy a jednak frakci fosforylcholin vázajících proteinů z býčí semenné plasmy. Tyto afinitní matrice pak byly použity pro studium interakcí imobilizovaných ligandů se složkami oviduktálních epithelů. Byly izolovány dva preparáty oviduktálních membránových proteinů oblasti isthmu: celkové membránové proteiny a apikální frakce membránových proteinů. Tyto membránové preparáty byly separovány pomocí afinitní chromatografie s použitím připravených afinitních nosičů. Afinitní chromatografie ani v jednom případě neposkytla dostatečné množství membránových složek interagujících s afinitními nosiči pro další studie. Dále byla pozornost věnována identifikaci čtyř proteinových zón detekovaných po elektroforetické separaci v přítomnosti SDS (relativní molekulová hmotnost 15 500 - 18 500) ve frakci apikálních membránových proteinů Tyto proteiny byly identifikován po elektroforetické separaci a tryptickém štěpení pomocí...
|
|
| |
|
| |
host ::
RSS.