|
|
Transgenic RNAi in mouse oocytes
Sarnová, Lenka ; Svoboda, Petr (vedoucí práce) ; Petr, Jaroslav (oponent)
RNA interference (RNAi) is double-stranded RNA (dsRNA)-mediated mRNA degradation. RNAi has been widely used to investigate gene functions. Many methods to induce transient or stable RNAi have been developed. Transient RNAi can be induced by delivering of a long dsRNA or short interfering RNAs (siRNAs). Stable RNAi may be induced by introducing plasmids expressing a long or a short hairpin RNA. Both small and long RNAs have been used to induce transient RNAi in mouse oocytes. Nevertheless, only long hairpin-expressing system has been used to trigger stable RNAi in oocytes. Although, this system appeared to be highly efficient and specific, it has several disadvantages as complicated long inverted repeat cloning or limited possibility to test these vectors in the cell culture. Here, we constructed a short hairpin-expressing vector suitable for transgenic RNAi induction in mouse oocytes. The new vector, pTMP_ZP3_sh, was derived from a lentiviral short hairpin vector selected based on comparative study of different short hairpin-expressing plasmids. The pTMP_ZP3_sh vector was tested by targeting Moloney sarcoma oncogene (Mos) mRNA, which is a common model for RNAi in mouse oocytes. We designed several candidate short hairpin sequences and tested their efficacy. Subsequently, the most efficient one was selected...
|
|
|
Role and regulation of nuclear membrane during meiotic maturation of mammalian oocyte
Končická, Markéta ; Kubelka, Michal (vedoucí práce) ; Petr, Jaroslav (oponent) ; Binarová, Pavla (oponent)
(česky) Meiotické dělení samičí zárodečné buňky, oocytu, je více náchylné k chybám a následně k aneuploidiím, než je tomu během meiózy spermií. Aneuploidie a chromozomální aberace se u oocytů zvyšují se zvyšujícím se věkem matky a to jak u lidí, tak u myší. Zahájení meiotického zrání je spojeno s aktivací cyklin-dependentní kinázy 1 (CDK1), což vede k rozpadu jaderné membrány. Kromě toho je pro správný průběh meiózy nezbytná regulace translace klíčových transkriptů. V této disertační práci jsou shrnuty poznatky ze čtyř vědeckých publikací. Analyzovali jsme čas rozpadu jaderné membrány (NEBD) a vydělení prvního pólového tělíska u oocytů pocházejících od samic 2 rozdílných věkových kategorií: mladých (2 měsíce věku) a starých (12 měsíců věku). Zjistili jsme, že meiotické zrání u oocytů starých samic probíhá výrazně rychleji díky dřívější fosforylaci Laminu A/C, který je komponentem jaderné laminy, a rychlému rozpadu jaderného obalu. Mimo to oocyty starých samic vykazují unikátní charakteristické invaginace jaderné membrány a také signifikantně delší obvod jaderného obalu v porovnání s oocyty mladých samic. Tato data spolu se zvýšenou aktivitou CDK1 a Cyklinu B a také se zvýšenou translací faktorů účastnících se regulace translace naznačují, že oocyty starých samic procházejí předčasným meiotickým...
|
|
|
The effects of long double-stranded RNA expression in mammalian cells.
Nejepínská, Jana ; Svoboda, Petr (vedoucí práce) ; Petr, Jaroslav (oponent) ; Štefl, Richard (oponent)
Dvouvláknová RNA je cizorodá molekula, která se objevuje v buňce buď jako produkt replikace viru nebo vzniká párováním komplementárních RNA, a to v rámci jedné molekuly nebo mezi dvěma molekulami. Komplementární RNA často pocházejí z repetitivních sekvencí. U savců může dvouvláknová RNA vstupovat do jedné ze tří drah: sekvenčně specifického umlčování RNA (RNA silencing), sekvenčně nezávislé interferonové (IFN) odpovědi nebo editace pomocí adenosin deamináz. Hlavním zaměřením mého PhD projektu bylo detailně zanalyzovat efekty dvouvláknové RNA produkované v savčích buňkách, a to v rámci celého organismu. Za tímto účelem jsme vytvořili konstrukt exprimující dvouvláknovou RNA ve formě mRNA, obsahující dlouhou a perfektně párující vlásenkovitou strukturu. Transgenní myši, vytvářející dvouvláknovou RNA ve všech buňkách, byly životaschopné a, na rozdíl od výsledků dosavadních studií, neměly aktivovanou IFN odpověď. V somatických buňkách byla dvouvláknová RNA jen málo štěpena na krátké interferující RNA (siRNA), nezpůsobovala transkripční umlčování v trans a docházelo k mírné deaminaci adenosinu bez zadržování editované RNA v jádře. Shodné výsledky jsme získali v savčích buňkách, které byly tranzientně transfekovány plazmidem exprimujícím dvouvláknovou RNA. Naproti tomu ve vajíčcích způsobovala...
|
|
|
Phenotypic study Huntington's disease TgHD minipigs: Appearance and progress of reproductive and biochemical changes
Bohuslavová, Božena ; Motlík, Jan (vedoucí práce) ; Roth, Jan (oponent) ; Petr, Jaroslav (oponent) ; Krylov, Vladimír (oponent)
Huntingtonova choroba (HCH) patrí k nevyliečiteľným ochoreniam s fatálnym koncom. Zaraďujeme ju k monogénnym neurodegeneratívnym ochoreniam. Podľa počtu opakovaní CAG repetícii v géne kódujúcom huntingtín, nástup ochorenia môže byť v detskom veku (5%), strednom veku - najčastejšie (90%) a vyššom veku (5%). Začiatok choroby sa prejaví zmenami v správaní, ku ktorým sa pridružia problémy s koordináciou a pohybom. Neskôr dochádza k psychickým zmenám. Ochorenie končí smrťou. V dnešnej dobe zatiaľ nie je vyvinutá účinná liečba. Doktori momentálne len príznaky farmakologicky utlmujú, ale nelieči sa príčina choroby. Na našom ústave v Liběchove sme v roku 2009 vytvorili model transgénneho miniprasaťa (TgHD) nesúceho N - terminálnu časť ľudského mutovaného huntingtínu (mtHtt). Dostatok potomkov a veľká príbuznosť fyziológie a morfológie medzi prasaťom (Sus scrofa) a človekom (Homo sapiens) nám dáva dostatok možnosti na študovanie zmien v centrálnych nervových orgánoch, ale i v periférnych tkanivách. Ako prvé zmeny fenotypu sme pozorovali reprodukčné problémy TgHD kancov. Preto sa moja práca v prvom rade zamerala na komplexné preštudovanie reprodukčných parametrov TgHD kancov, rovnako ako na ultraštrukturálne, imunocytochemické a biochemické zmeny v tkanivách semenníkov a v spermiách. V tejto práci som...
|
|
| |
|
|
Testicular Degeneration of Transgenic Porcine Model of Huntington's Disease
Skřivánková, Monika ; Motlík, Jan (vedoucí práce) ; Roth, Jan (oponent) ; Petr, Jaroslav (oponent)
Huntingtonova choroba je autozomálně dominantní neurodegenerativní onemocnění způsobené prodlouženou (≥36) CAG repeticí v genu pro huntingtin. Jejím charakteristickým znakem je atrofie mozku, ale huntingtin je široce deponován ve všech tkáních těla, nejvíce v mozku a varlatech. Jeho patogenní účinek je podmíněn tvorbou cytotoxických forem agregátů a fragmentů, které se vyskytují jak v mozku, tak v periferních tkáních. Atrofie varlat byla prokázána v posmrtných vzorcích lidských pacientů s Huntingtonovou chorobou a u transgenních myších modelů. Zkoumali jsme pokles reprodukčních schopností u velkého zvířecího modelu Huntingtonovy choroby. Transgenní model (tgHD) miniprasete byl vytvořen vložením lentivirového vektoru do genómu prasete. Ten obsahoval zkrácenou formu N terminální části lidského mutovaného huntingtinu. Kanci této transgenní linie vykazovali od 13 měsíců věku sníženou schopnost plodit potomstvo. Potvrdili jsme apoptózu buněk spermagenní linie a Sertoliho buněk a výskyt morfologicky poškozených spermií, které nebyly schopny účinně oplodnit oocyt v podmínkách in vitro. U spermií tgHD kanců jsme zjistili snížení parametrů mitochondriálního metabolismu. Tyto změny nebyly závislé na věku kanců, přímo souvisí s výskytem mutovaného huntingtinu ve varlatech a spermiích transgenních kanců, což...
|
|
|
RNA interference in mouse oocytes and somatic cells
Táborská, Eliška ; Svoboda, Petr (vedoucí práce) ; O´Connell, Mary Anne (oponent) ; Petr, Jaroslav (oponent)
RNA interference (RNAi) je dráha, ve které Dicer štěpí dlouhé dvouvláknové RNA endogenního a exogenního původu na krátké interferující RNA (siRNA). Tyto siRNA jsou předány Argonaut proteinům, které jsou efektory sekvenčně specifického post-transkripčního umlčování RNA. RNAi reguluje protein-kodující geny a retrotranspozony nebo zprostředkuje protivirovou imunitní odpověď. Další dráha malých RNA - dráha RNA associovaných s PIWI proteiny (piRNA dráha) umlčuje retrotranspozony v zárodečné linii. Aktivita kanonické RNAi dráhy je v myších somatických buňkách nevýznamná. Dlouhá varianta Diceru zde produkuje mikroRNA (miRNA) které regulují (protein-kodující) geny. RNAi je naopak vysoce aktivní v oocytech, které produkují zkrácenou oocyt-specifickou isoformu Diceru (DicerO ). DicerO nemá N-koncovou DExD helikázovou doménu a má zvýšenou schopnost štěpit dlouhé dvouvláknové RNA. Delece oocyt-specifického promotoru DicerO vede ke globální deregulaci transkriptomu včetně zvýšené exprese domnělých cílových molekul RNAi a MT retrotranspozonů. V důsledkem je defect meiotického vřeténka a neplodnost samic. Oproti tomu piRNA dráha je pro myší oocyty neesenciální, pravděpodobně kvůli překrývající se funkci s RNAi. Tato doktorská práce má za cíl porozumět biologickému významu savčí endogenní RNAi and prozkoumat...
|
|
|
Vliv bisfenolu S na vybrané markery meiotického zrání prasečích oocytů
Černíková, Terezie ; Petr, Jaroslav (vedoucí práce) ; Krylov, Vladimír (oponent)
Bisfenol A (BPA) je chemická látka, široce používaná k výrobě plastů. Přítomnost BPA v životním prostředí negativně ovlivňuje lidské zdraví z důvodu kontaminace vzduchu, pitné vody a potravin. Vzrůstající obavy z účinků BPA vedly k jeho regulacím ve výrobě a k vytvoření alternativ, mimo jiné například bisfenolu S (BPS). Avšak před uvedením BPS na trh nebyly jeho účinky řádně testovány a jeho vliv na lidskou reprodukci je zatím neznámý. Z tohoto důvodu je žádoucí testovat vliv BPS na vývoj savčích oocytů. Tato práce předpokládá hypotézu, že expozice BPS způsobuje změny v průběhu meiotického zrání prasečích oocytů in vitro. Cílem této práce je zkoumat vliv BPS v nízkých koncentracích, odpovídajících běžným expozicím člověka, na vybrané meiotické proteiny prasečích oocytů. Výsledky práce demonstrují negativní vliv BPS na progresi meiotického zrání a dosažení stadia zralého oocytu. Kromě toho výsledky prokazují nárůst tvorby defektních dělících vřeten a narušení mitochondriální integrity po kultivaci v BPS. Nicméně vliv BPS na výskyt dvouvláknových zlomů DNA nebyl v této studii prokázán, jako tomu bylo v případě BPA. Souhrnně výsledky prokazují, že BPS má obdobné či větší dopady na meiotické zrání savčích oocytů a jedná se tedy o nevhodně zvolenou náhradu za BPA. Klíčová slova: oocyt, meiotické zrání,...
|
|
|
The development of tourism potential in Ghana using social media as a marketing tool
Petr, Jaroslav
Cílem mé bakalářské práce je analyzovat rozvoj cestovního ruchu pomocí sociálních médií jako marketingového nástroje. První část, přehled literatury, pojednává o podmínkách světového cestovního ruchu, cestovním ruchu v Africe, cestovním ruchu v Ghaně a typech sociálních médií. Druhá praktická část se zabývá současnou situací, ve které sociální média pomáhají při rozvoji cestovního ruchu a jsou nejvhodnější pro prezentaci. Praktická část je založena na výzkumu států, konkrétně měst, které díky marketingu na sociálních sítích zvýšily podíl cestovního ruchu. Součástí praktické části je i výzkumný dotazník o místním cestovním ruchu v Ghaně. Závěr a doporučení, které by Ghana nebo agentura, která je zastupuje na sociálních sítích, by měly být prováděny na základě výzkumu a analýzy.
|
|
|
Mechanismus a rizikové faktory vzniku monozygotických dvojčat u savců
Žabková, Světlana ; Krylov, Vladimír (vedoucí práce) ; Petr, Jaroslav (oponent)
Monozygotická dvojčata jsou výsledkem rozdělení embrya během časného embryonálního vývoje. Vývojové stádium, ve kterém nastane rozdělení, je klíčovým faktorem určujícím stupeň sdílení plodových obalů. Etiologie a mechanismus vzniku monozygotických dvojčat nejsou zatím zcela objasněny. K pravidelnému přirozenému výskytu monozygotických vícečetných těhotenství dochází mezi savci pouze u člověka a dvou druhů pásovců, Dasypus novemcinctus a Dasypus hybridus. Spontánní výskyt u člověka se uvádí jako 0,45 % všech narozených. Se vzrůstajícím zájmem o metody asistované reprodukce ale roste i frekvence těhotenství s monozygotickými dvojčaty. V jistém ohledu lze monozygotická dvojčata také chápat jako vážný vedlejší efekt léčby neplodnosti, neboť monozygotická dvojčata se vyznačují mnohem vyšší prenatální mortalitou, předčasnými porody a vrozenými anomáliemi než jednočetná těhotenství. Tato bakalářská práce si pokládá za cíl shrnout získané poznatky o vzniku monozygotických dvojčat u savců. Rovněž se snaží diskutovat potenciální mechanismy a rizikové faktory, které mohou ovlivnit jejich vznik. Monozygotická dvojčata jsou důležitým modelem pro objasnění genetické predispozice řady onemocnění. Práce také v krátkosti naznačí, jakými způsoby lze monozygotická dvojčata experimentálně produkovat. Klíčová slova:...
|
host ::
RSS.