|
|
Charakterizace perinukleárních aktinových vláken a jejich funkce v buněčné migraci
Hlaváčková, Tereza ; Vomastek, Tomáš (vedoucí práce) ; Binarová, Pavla (oponent)
Fyziologické a patologické jevy jako je hojení ran, embryonální vývoj, imunitní odpověď nebo rozsev nádorových buněk primárního nádoru, úzce souvisí s buněčnou migrací. Tento děj je spojený s procesy polarizace buňky, translokace jádra a přestavby buněčného cytoskeletu. Významnou roli zde hraje aktinový cytoskelet. Součástí aktinového cytoskeletu, zatím s málo prozkoumanou funkcí, jsou perinukleární aktinová vlákna tvořící nad jádrem strukturu aktinové čepičky. Vlákna jsou nad jádrem asociována s LINC komplexem a přichycena na obou koncích fokálními adhezemi, čímž tvoří nad jádrem kopulovitou strukturu. Předpokládá se, že tato vlákna mohou generovat síly regulující pohyb jádra při buněčné migraci. Cílem práce bylo objasnění mechanizmu, který se podílí na přichycení perinukleárních aktinových k LINC komplexu a jádru a reguluje tak vznik perinukleární aktinové čepičky. Dalším cílem bylo zavedení metody pro kvantifikaci perinukleárních aktinových vláken pomocí nově vyvinutého digitálního nástroje. Pro experimenty byly využité potkaní fibroblasty, protože obsahují dobře vyvinutá perinukleární vlákna. Inaktivací genů pro specifické proteiny nespriny, které jsou součástí LINC komplexu, jsme chtěli lépe porozumět buněčné migraci s absencí perinukleární aktinové čepičky. Nicméně se ukázalo, že inaktivace...
|
|
|
Charakteristika stresových granulí u kvasinky Saccharomyces cerevisiae
Slabá, Renata ; Hašek, Jiří (vedoucí práce) ; Binarová, Pavla (oponent)
8 ABSTRAKT Ke své správné funkci musí proteiny mít nativní konformaci. Pokud dojde k narušení konformace vlivem vnějších podmínek nebo genetické mutace, proteiny se stávají náchylnější k agregaci. Existují různé typy proteinových agregátů. Mohou se vytvářet různě stabilní bezmembránové inkluze, které slouží k odklizení poškozených proteinů z míst, kde by mohly interferovat s důležitými buněčnými procesy. Jiné typy agregátů mohou sloužit k přechodnému uskladnění proteinů a tím je chránit před poškozením v důsledku stresu. Jedním z těchto přechodných typů agregátů jsou stresové granule (SG), jejichž tvorbu indukuje např. tepelný stres. SG obsahují mRNA, složky translačního aparátu a řadu dalších proteinů. Jedním z nich je protein Mmi1, malý vysoce konzervovaný protein s neznámou funkcí. Jeho asociace se stresovými granulemi a částečná kolokalizace s chaperonem Cdc48 a proteasomem indikuje, že by mohl zprostředkovávat degradaci proteinů poškozených tepelným stresem. Zjistili jsme, že kvasinkový prionový protein Sup35 je také složkou stresových granulí. Vzhledem k jeho schopnostem agregace proto existoval předpoklad, že jeho prionová doména by mohla sloužit jako lešení pro sestavování SG. Nicméně ukázali jsme, že delece prionové domény tohoto proteinu dynamiku tvorby stresových granulí neovlivňuje. Kvasinka...
|
|
|
Functional characterization of selected microtubule regulatory
Vinopal, Stanislav ; Dráber, Pavel (vedoucí práce) ; Binarová, Pavla (oponent) ; Hašek, Jiří (oponent)
SOUHRN Mikrotubuly (MTs) hrají zásadní roli ve vnitřní organizaci buňky a vnitrobuněčném transportu, v regulaci polarity, pohyblivosti a přenosu signálů i v buněčném dělení a diferenciaci. MTs vytvářejí složité struktury, které jsou díky jejich dynamické povaze schopné rychlé reorganizace dle potřeb buňky. Dynamika, stabilita a prostorové uspořádání MTs jsou regulovány mnoha faktory. Jedním z nich jsou proteiny regulující MTs. V této práci jsme se zabývali funkční charakterizací tří proteinů regulujících MTs: Ca2+ -senzoru STIM1, spastinu, proteinu štěpícího MTs, a γ-tubulinu, který je zásadní pro nukleaci MTs. Zjistili jsme, že aktivace žírných buněk kostní dřeně (BMMCs) vede ke tvorbě výběžků cytoplasmatické mebrány, které obsahují MTs. Tvorba těchto MT výběžků je závislá na transportu extracelulárních Ca2+ iontů do buňky, který je řízen proteinem STIM1 lokalizovaným na endoplasmatickém retikulu. STIM1 se váže na MTs a potlačení jeho exprese zabraňuje tvorbě MT výběžků. To naznačuje, že Ca2+ ionty mohou hrát roli při regulaci MTs. Jelikož snížení exprese STIM1 způsobuje také poruchy chemotaxe, popsané MT výběžky mohou být hypoteticky důležité pro vnímání vnějších signálů. Glioblastoma multiforme je nejčastější a nejagresivnější maligní primární nádor mozku u člověka, jehož možnosti léčby jsou dosud velmi...
|
|
|
Following the Arp2/3-based processes in plant cells
Fišerová, Jindřiška ; Opatrný, Zdeněk (vedoucí práce) ; Binarová, Pavla (oponent) ; Dráber, Pavel (oponent)
1. ABSTRACT An actin cytoskeleton comprises an essential cytoskeletal structure that organizes a cytoplasm during number of processes occurring in animal and plant cells, such as cell division and growth, formation of membrane protrusions and cellular movement or cytoplasmic streaming. A dynamic actin net and an exact spatial and temporal actin filament organization is, therefore, necessary for correct growth processes and development of multicellular organism. Depolymerization and re-establishment of actin arrays is mediated by actin associated proteins. Among them, an Arp2/3 complex (actin related protein 2 and 3) plays an important role as a catalyst of the actin filament nucleation and, thus, enables the formation of dynamic actin network. In non-plant cells, Arp2/3 complex-dependent polymerization of actin filaments is required for movement of whole cells (fibroblasts or keratocytes), it drives organels and pathogens throughout the cell or mediates endocytic processes. The role of the Arp2/3 complex in non-motile plant cells is despite the considerable effort over last three years far from being understood. Unlike animals, where loss-of-function mutations in the Arp2/3 complex are lethal, only limited number of cell types show significant phenotype in Arabidopsis mutants. The evidence exists that the...
|
|
|
Analýza mutantů Rpg1/eIF3a v Saccharomyces cerevisiae.
Luxová, Pavla ; Malcová, Ivana (vedoucí práce) ; Binarová, Pavla (oponent)
Rpg1/Tif32/eIF3a je esenciální a největší podjednotkou translačního iniciačního faktoru eIF3 kvasinky Saccharomyces cerevisiae. Vedle jejích interakcí v rámci eIF3 komplexu byla již dříve popsána též její vlastnost interagovat s mikrotubuly. Předběžné výsledky laboratoře s kmeny v genetickém pozadí W303 ukázaly na existenci syntetického fenotypu rpg1-2 mutanty s mikrotubulárním inhibitorem nokodazolem. Cílem této práce byla analýza "mikrotubulárního fenotypu" rpg1-2 mutanty a objasnění možného vlivu odlišného genetického pozadí. Prokázala jsem, že nezávisle na genetickém pozadí kmene (W303, BY, SEY) byly všechny analyzované mutanty rpg1-1, rpg1-2 a rpg1-3 termosenzitivní. Zjistila jsem však, že tyto mutanty v BY a SEY genetickém pozadí za nepermisivních podmínek (37řC, 4 h) nevykazují terminální fenotyp a nezastaví buněčný cyklus v G1 fázi, tak jak bylo popsáno dříve u kmenů pozadí W303. Tyto mutantní kmeny také nevykazovaly zvýšenou citlivost k benomylu a žádná z testovaných mutací v těchto kmenech neovlivňuje obnovu mikrotubulárního systému po uvolnění z působení nokodazolu. Připravila jsem nové kmeny s kombinací delece genu BUB1 s jednotlivými testovanými termosenzitivními mutacemi v genu RPG1. Podrobná fenotypová analýza těchto dvojitých mutantů ukázala, že disfunkce obou genových produktů vede...
|
|
|
Funkční charakterizace podjednotky Sec5 komplexu exocyst u rostlin.
Sekereš, Juraj ; Žárský, Viktor (vedoucí práce) ; Binarová, Pavla (oponent)
Exocyst je proteinový complex hrající roli v sekretorické dráze eukaryotických buněk. K plasmatické membráně připoutává váčky, které následně s membránou splynou díky aktivitě SNARE proteinů. V současnosti je jeho funkce studována u kvasinek, živočichů, ale i u rostlin. Tato práce se zabývá studiem podjednotky komplexu Sec5 u modelového rostlinného organismu Arabidopsis thaliana. Lokalizace a dynamika tohoto proteinu značeného fluorescenčním proteinem GFP byla studováne na vnitrobuněčné úrovni pomocí mikroskopie, včetně metody VAEM/TIRF. Sec5 je protein lokalizován v cytoplasmě buněk kořene. Protein se také vyskytuje na cytoplasmatické membráně buněk s vysokou sekreční aktivitou a ve zrajících přepážkách v pozdějších fázích buněčného dělení. Doplňování proteinu na membránu částečně závisí na aktinovém cytoskeletu. Závěry práce se shodují s poznatky o dalších podjednotkách komplexu exocyst organismu Arabidopsis thaliana, které byly získány podobnými metodami. Práce přináší výsledky, které spolu s předchozími poukazují na funkci proteinu Sec5 v rámci komplexu exocyst.
|
|
|
Specificity of selected exocyst subunits in trichome development
Glanc, Matouš ; Žárský, Viktor (vedoucí práce) ; Binarová, Pavla (oponent)
Trichomy jsou jemné struktury epidermálního původu, které pokrývají povrch nadzemních orgánů většiny rostlin. Jednobuněčné trichomy Arabidopsis thaliana jsou dobře zavedeným modelem v buněčné a vývojové biologii rostlin, přesto je o procesech ukládání buněčné stěny během finální fáze zrání trichomu známo jen velmi málo. V naší laboratoři byla nedávno objevena role podjednotky poutacího komplexu exocyst EXO70H4 při zrání trichomu. V této práci byly za použití analýzy obrazu, histochemického barvení a FT-IR spektroskopie studovány defekty v buněčné stěně u ztrátového mutanta exo70H4. Bylo zjištěno, že mutace vede ke změně v ukládání pektinu a možná též ligninu a hemicelulóz. Byly připraveny transgenní linie s paralogy EXO70 exprimovanými pod promotorem EXO70H4 a jejich analýza ukázala, že nejbližší paralog EXO70H3 dokáže komplementovat mutaci EXO70H4, na rozdíl od paralogů EXO70A1 a EXO70B1. Na základě těchto výsledků jsou diskutovány otázky týkající se složení buněčné stěny trichomů, role EXO70H4 ve zrání trichomu a funkcí komplexu exocyst u rostlin. Klíčová slova: Arabidopsis, trichom, buněčná stěna, sekreční dráha, komplex exocyst, EXO70H4, FT-IR spektroskopie
|
|
|
Role and regulation of nuclear membrane during meiotic maturation of mammalian oocyte
Končická, Markéta ; Kubelka, Michal (vedoucí práce) ; Petr, Jaroslav (oponent) ; Binarová, Pavla (oponent)
(česky) Meiotické dělení samičí zárodečné buňky, oocytu, je více náchylné k chybám a následně k aneuploidiím, než je tomu během meiózy spermií. Aneuploidie a chromozomální aberace se u oocytů zvyšují se zvyšujícím se věkem matky a to jak u lidí, tak u myší. Zahájení meiotického zrání je spojeno s aktivací cyklin-dependentní kinázy 1 (CDK1), což vede k rozpadu jaderné membrány. Kromě toho je pro správný průběh meiózy nezbytná regulace translace klíčových transkriptů. V této disertační práci jsou shrnuty poznatky ze čtyř vědeckých publikací. Analyzovali jsme čas rozpadu jaderné membrány (NEBD) a vydělení prvního pólového tělíska u oocytů pocházejících od samic 2 rozdílných věkových kategorií: mladých (2 měsíce věku) a starých (12 měsíců věku). Zjistili jsme, že meiotické zrání u oocytů starých samic probíhá výrazně rychleji díky dřívější fosforylaci Laminu A/C, který je komponentem jaderné laminy, a rychlému rozpadu jaderného obalu. Mimo to oocyty starých samic vykazují unikátní charakteristické invaginace jaderné membrány a také signifikantně delší obvod jaderného obalu v porovnání s oocyty mladých samic. Tato data spolu se zvýšenou aktivitou CDK1 a Cyklinu B a také se zvýšenou translací faktorů účastnících se regulace translace naznačují, že oocyty starých samic procházejí předčasným meiotickým...
|
|
|
Functional studies of selected members of the Arabidopsis formin family
Oulehlová, Denisa ; Cvrčková, Fatima (vedoucí práce) ; Binarová, Pavla (oponent) ; Černý, Jan (oponent)
Souhrn Forminy jsou multidoménové proteiny obsahující konzervovanou FH2 doménu (forminhomology 2 domain), která je schopna katalyzovat nukleaci aktinových filament de novo. Funkce forminu, stejne jako jejich regulace, byly podrobne studovány predevším u kvasinek a živocichu, zatímco mnohem méne je známo o rostlinných forminech, které se od kvasinkových i živocišných zástupcu znacne liší v doménovém usporádání. Forminy vyšších rostlin se delí do dvou skupin, trídy I a trídy II a experimentální údaje jsou doposud k dispozici pouze pro první skupinu. V této dizertaci predkládám výsledky z experimentální studie nekolika zástupcu velké rodiny forminu u Arabidopsis, vcetne charakterizace forminu AtFH16 z trídy II. Genom Arabidopsis obsahuje 21 genu kódujících forminy, a prestože se hladina a rozložení jejich exprese znacne liší, všechny jsou transkripcne aktivní. V celkem 14-ti forminových genech jsme získali 17 homozygotních mutantu s T-DNA inzercí. Za standartních kultivacních podmínek jsme nenašli zjevné odlišnosti ve fenotypech mutantu v porovnání s kontrolami. Abychom vyradili z funkce dva dominantní pylové forminy, pripravili jsme dvojitého mutanta atfh3atfh5, avšak i v tomto prípade se vývoj mikrospor a následné klícení a rust pylových lácek nezmenily. Stejne tak nedošlo k narušení polarizovaného rustu...
|
|
|
Role and regulation of nuclear membrane during meiotic maturation of mammalian oocyte
Končická, Markéta ; Kubelka, Michal (vedoucí práce) ; Petr, Jaroslav (oponent) ; Binarová, Pavla (oponent)
(česky) Meiotické dělení samičí zárodečné buňky, oocytu, je více náchylné k chybám a následně k aneuploidiím, než je tomu během meiózy spermií. Aneuploidie a chromozomální aberace se u oocytů zvyšují se zvyšujícím se věkem matky a to jak u lidí, tak u myší. Zahájení meiotického zrání je spojeno s aktivací cyklin-dependentní kinázy 1 (CDK1), což vede k rozpadu jaderné membrány. Kromě toho je pro správný průběh meiózy nezbytná regulace translace klíčových transkriptů. V této disertační práci jsou shrnuty poznatky ze čtyř vědeckých publikací. Analyzovali jsme čas rozpadu jaderné membrány (NEBD) a vydělení prvního pólového tělíska u oocytů pocházejících od samic 2 rozdílných věkových kategorií: mladých (2 měsíce věku) a starých (12 měsíců věku). Zjistili jsme, že meiotické zrání u oocytů starých samic probíhá výrazně rychleji díky dřívější fosforylaci Laminu A/C, který je komponentem jaderné laminy, a rychlému rozpadu jaderného obalu. Mimo to oocyty starých samic vykazují unikátní charakteristické invaginace jaderné membrány a také signifikantně delší obvod jaderného obalu v porovnání s oocyty mladých samic. Tato data spolu se zvýšenou aktivitou CDK1 a Cyklinu B a také se zvýšenou translací faktorů účastnících se regulace translace naznačují, že oocyty starých samic procházejí předčasným meiotickým...
|
host ::
RSS.