|
|
Klinicky relevantní protein-proteinové interakce v procesu bakteriální patogeneze B. pertusis
Málek, Albert ; Šulc, Miroslav (vedoucí práce) ; Černá, Věra (oponent)
Výskyt černého kašle v lidské populaci byl v průběhu 20. století díky vakcinaci silně potlačen. V posledních letech však začala inicidence černého kašle opět narůstat. Původcem této nemoci je patogenní gramnegativní bakterie Bordetella pertussis, která začíná být rezistentní vůči dosud používaným antibiotikům či vakcínám. B. pertussis napadá dýchací cesty člověka. Jedním z jejích virulentních faktorů je adenylátcyklázový toxin (ACT). Ten je sekretován z bakteriálních buněk do extracelulárního prostoru, váže se na plasmatickou membránu hostitelské buňky a translokuje do jejího cytosolu adenylátcyklázovou doménu (dAC). Tato enzymatická doména se aktivuje nekovalentní interakcí s eukaryotním kalmodulinem (CaM) a syntetizuje cAMP, jehož nadbytek má za následek apoptózu hostitelské buňky. Proteinovou interakci dAC s CaM jsme studovali pomocí metody PIXL (fotochemické zesítění, z angl. "Photo Induced Cross Linking") a hmotnostní spektrometrie (MS). Mutantní protein dAC, s inkoroporovaným foto-Methioninem (pM) na pozici Leucinu 240 (dACL240pM), jsme exprimovali v transformovaných buňkách E. coli B834 v minerálním médiu s pM. Exprimovaný protein jsme izolovali afinitní chromatografií a pomocí MS stanovili inkorporaci pM do primární struktury dAC na přibližně 50 % ve finálním preparátu. S izolovaným...
|
|
| |
|
|
Klinicky relevantní protein-proteinové interakce v procesu bakteriální patogeneze B. pertusis
Málek, Albert ; Šulc, Miroslav (vedoucí práce) ; Černá, Věra (oponent)
Výskyt černého kašle v lidské populaci byl v průběhu 20. století díky vakcinaci silně potlačen. V posledních letech však začala inicidence černého kašle opět narůstat. Původcem této nemoci je patogenní gramnegativní bakterie Bordetella pertussis, která začíná být rezistentní vůči dosud používaným antibiotikům či vakcínám. B. pertussis napadá dýchací cesty člověka. Jedním z jejích virulentních faktorů je adenylátcyklázový toxin (ACT). Ten je sekretován z bakteriálních buněk do extracelulárního prostoru, váže se na plasmatickou membránu hostitelské buňky a translokuje do jejího cytosolu adenylátcyklázovou doménu (dAC). Tato enzymatická doména se aktivuje nekovalentní interakcí s eukaryotním kalmodulinem (CaM) a syntetizuje cAMP, jehož nadbytek má za následek apoptózu hostitelské buňky. Proteinovou interakci dAC s CaM jsme studovali pomocí metody PIXL (fotochemické zesítění, z angl. "Photo Induced Cross Linking") a hmotnostní spektrometrie (MS). Mutantní protein dAC, s inkoroporovaným foto-Methioninem (pM) na pozici Leucinu 240 (dACL240pM), jsme exprimovali v transformovaných buňkách E. coli B834 v minerálním médiu s pM. Exprimovaný protein jsme izolovali afinitní chromatografií a pomocí MS stanovili inkorporaci pM do primární struktury dAC na přibližně 50 % ve finálním preparátu. S izolovaným...
|
|
|
Studium strukturně funkčních vztahů elektrotransportních proteinových systémů
Tuzhilkin, Roman ; Šulc, Miroslav (vedoucí práce) ; Kukačka, Zdeněk (oponent)
Studium procesů spojených s přenosem elektronu v proteinech je velice důležitou oblastí moderní biochemie a strukturní/funkční proteomiky. Azurin je jedním z nejpoužívanějších modelových systémů pro studium oxidačně-redukčních a elektron transportních procesů v proteinech. V této práci jsme použili metodiku kovalentního fotochemického zesítění (PIXL) pro studium oligomerizace azurinu v roztoku. Zároveň jsme studovali vliv L-2- amino-5,5-azi-hexanové kyseliny (foto-Met), strukturního světlem indukovatelného analogu přirozené aminokyseliny Met, na elektron transportní procesy v azurinu. Byla provedena optimalizace podmínek exprese rekombinantního azurinu v auxotrofních buňkách E. coli B834 za účelem získání azurinu s maximální mírou inkorporace foto-Met (70% inkorporace určená MALDI-TOF hmotnostní spektrometrií). Současně modifikací purifikačního protokolu (např. rozbití buněk, kyselá precipitace proteinů, zavedení kovového ligandu při sonikaci buněk) jsme zvýšili čistotu a výtěžek preparátu a zkrátili dobu purifikace. Získané preparáty azurinu (přirozený protein (WT) s Met, WT s foto-Met a "All-Phe" mutant (všechny Trp/Tyr zaměněny za Phe) s foto-Met) byly po ozáření UV světlem (metodika PIXL) charakterizovány pomocí UV-VIS spektroskopie a SDS-PAGE. Při experimentu PIXL některý z foto-Met zavedených...
|
host ::
RSS.