|
|
Příprava lidského a schistosomálního kathepsinu L v enzymaticky aktivní formě
Horáková, Lenka ; Mareš, Michael (vedoucí práce) ; Ječmen, Tomáš (oponent)
Kathepsinové proteasy typu L se účastní řady patologických procesů a jejich inhibitory jsou atraktivními molekulami pro vývoj nových léčiv. Diplomová práce se zabývá lidským kathepsinem L (hCL) a kathepsinem L3 z parazitické krevničky střevní (Schistosoma mansoni) (SmCL3). hCL je spojován s nádorovými onemocněními a Covid-19, zatímco SmCL3 je trávicím enzymem S. mansoni způsobující onemocnění schistosomózu. Cílem diplomové práce byla příprava rekombinantních kathepsinů L v enzymaticky aktivní formě citlivé k inhibitorům. V případě hCL byly identifikovány podmínky pro řízenou autoaktivaci prekurzorových forem na zralou formu enzymu a optimalizovat tento proces závislý na pH a teplotě. V případě SmCL3 byl navržen protokol pro purifikaci zralé formy z expresních médií kvasinky Komagataella pastoris. Senzitivita připraveného hCL a SmCL3 k inhibici byla ověřena pomocí modelového peptidomimetického vinylsulfonu, jehož hodnoty IC50 byly v oblasti sub/nanomolárních koncentrací. Klíčová slova: proteolytické enzymy, aktivita a inhibice enzymů, funkční proteomika, rekombinantní exprese proteinů, struktura proteinů
|
|
|
Studium struktury a interakcí proteinů pomocí strukturní hmotnostní spektrometrie
Portašiková, Jasmína Mária ; Man, Petr (vedoucí práce) ; Vrbacký, Marek (oponent)
Transmembránové kanály a přenášeče z ClC proteinové rodiny se vyskytují napříč všemi živými organismy. Nacházejí se na cytoplasmatických a lysosomálních membránách buněk, kde se podílí na udržování homeostázy iontů. Narušení jejich funkce vede k vážným zdravotním komplikacím. Pro vývoj efektivní léčby těchto onemocnění je potřeba objasnit transportní mechanismus ClC proteinů. Antiporter ClC-ec1 z E.coli je modelovým proteinem celé ClC proteinové rodiny. Tento homodimerní protein, který transportuje proton proti dvěma chloridovým iontům, má transportní dráhu v každé z podjednotek. Na základě krystalové struktury se přepokládá, že během transportu se protein střídavě otevírá na obě strany membrány. Otevření proteinu směrem ven je umožněno protonací tří glutamátů, které se nacházejí v transportní dráze a jsou pro transport iontů klíčové. Pro studium tohoto stavu byl navržen QQQ mutant, který má tyto glutamáty nahrazeny za glutaminy. Dosud se studium transportního mechanismu ClC-ec1 opíralo převážně o studie založené na rentgenové krystalografii. Krystalografie poskytla statické obrázky, které neobsahovaly dostatečné informace o dynamice proteinu. Proto jsme pro studium transportního mechanismu ClC-ec1 zvolili dynamickou metodu - vodík-deuteriovou výměnu spojenou s hmotnostní spektrometrií. Součástí...
|
|
|
Predikce proteinových domén
Valenta, Martin ; Martínek, Tomáš (oponent) ; Burgetová, Ivana (vedoucí práce)
Práce představuje oblast proteinů a jejich domén. Stručně popisuje metody získání proteinové struktury na různých úrovních hierarchie. Pozornost je dále věnována existujícím nástrojům pro predikci proteinových domén a databázím sdružujícím informace o doménách. Dále jsou představeni vybraní zástupci metod predikce pracující jak s informacemi o vnitřní struktuře molekuly, tak se sekvencí aminokyselin. V příslušné kapitole je nastíněn realizovaný postup predikce hranic domén z primární struktury proteinu, využívající neuronovou síť. Zbývající část práce se zabývá testováním vytvořené implementace metodou křížové validace a možnostmi jejího dalšího rozvoje.
|
|
|
Počítačové simulace struktury proteinů pomocí zhrubených modelů
Halda, Miloš ; Nová, Lucie (vedoucí práce) ; Limpouchová, Zuzana (oponent)
Hlavní částí této bakalářské práce je funkční program pro simulace zhrubených modelů proteinů, vhodný pro testování funkcí potenciálu. Program využívá návrh stavu pomocí pivota a vyhodnocení nových stavů metodou Monte Carlo. Program také umožňuje využít metodu simulovaného žíhání s lineárním poklesem teploty a má zabudované základní nástroje pro vyhodnocení simulací (počítání průměrů a chyb blokovou metodou). Program byl otestován simulací několika reálných proteinů. Pro kratší proteiny (88 a méně aminokyselin) program fungoval podle očekávání, delší proteiny (111 a více aminokyselin) poukázaly na limity přístupu návrhu stavů pomocí pivota. Pro další vývoj bylo navrženo rozšíření možností návrhu nového stavu pro vylepšení simulací dlouhých řetězců. 1
|
|
|
Příprava a využití proteas vhodných ke studiu struktury proteinů.
Jirečková, Barbora ; Man, Petr (vedoucí práce) ; Vaňková, Pavla (oponent)
Vodík/deuteriová výměna spojená s hmotnostní spektrometrií (HDX-MS) je metoda, která umožňuje studium struktury a dynamiky proteinů. Pro lokalizaci této výměny je do HDX-MS zařazena proteolýza analyzovaného proteinu, která určuje prostorové rozlišení. Standardně se používá pepsin, který má ale své limitace, a také štěpení pouze jednou proteasou často neposkytuje optimální prostorové rozlišení. V několika publikacích byl akcentován význam alternativních proteas nepenthesinu-2 (Nep-2) a aspergillopepsinu (XIII), které oproti pepsinu štěpí za bazickými aminokyselinami. Při studiu na prolin bohatých proteinů získává význam prolyl endoproteasa z Aspergillus niger (AnPEP). Tato práce se zabývá charakterizací imobilizovaného AnPEPu v kombinaci s proteasami pepsinem, aspergillopepsinem nebo Nep-2 za účelem jejich aplikace v HDX-MS. Nejprve byly na sadě modelových proteinů otestovány kolony s pouze jednou proteasou. Bylo zjištěno, že imobilizovaný AnPEP oproti ostatním proteasám nemá optimální štěpné charakteristiky. Za účelem spojení výhod výše uvedených proteas byly modelové proteiny štěpeny pomocí kolon s AnPEP koimobilizovaným s pepsinem, Nep-2 nebo XIII a také pomocí dvou proteasových kolon v sériovém zapojení (vždy AnPEP kolona s pepsinovou, Nep-2 nebo XIII kolonou v obou směrech). V rámci štěpení...
|
|
|
Terapeutické využití alternativních vazebných proteinů cílící nádorové biomarkery v klinickém testování onkologických pacientů
Tauš, Petr ; Drbal, Karel (vedoucí práce) ; Lepšík, Martin (oponent)
Téměř až do konce minulého století byly protilátky (imunoglobuliny) považovány za jediné vazebné proteiny schopné specifické vazby. Objev hybridomové technologie v roce 1975 umožnil vytváření monoklonálních protilátek, které po dvaceti letech vstoupily do klinické praxe. V této době byly objeveny první neimunoglobulinové proteinové struktury vhodné pro vytvoření specifického vazebného místa. Do dnešní doby bylo popsáno mnoho odlišných struktur, ale pouze několik z nich je dále vyvíjeno jako diagnostika, terapeutika nebo jako nástroje ve výzkumu. Tyto struktury nejsou zatíženy nedostatky imunoglobulinů, jako je velikost, drahá výroba a obtížný racionální návrh, a proto mají potenciál nahradit a překonat současné využití protilátek. V této bakalářské práci jsou shrnuty veškeré struktury, které jsou ve vývoji a jsou popsány zástupci v klinickém testování v oblasti nádorových terapeutik v porovnání s některými schválenými imunoglobulinovými bioléčivy.
|
|
|
Adaptive evolution of Toll-like receptors in birds
Velová, Hana ; Vinkler, Michal (vedoucí práce) ; Elleder, Daniel (oponent) ; Novák, Karel (oponent)
Adaptive evolution of Toll-like receptors in birds Hana Velová, PhD thesis 7 Abstrakt Toll-like receptory (TLR) patří mezi klíčové a evolučně staré součásti imunitního systému zvířat. Jakožto receptory vrozené imunity tvoří první obrannou linii proti nejrůznějším patogenům. Správné navázání ligandů receptorem je přitom zcela zásadní pro bezchybné rozpoznání patogenů a následné spuštění přiměřené imunitní reakce. Protože zde dochází k přímé interakci mezi povrchem daného receptoru a patogenními strukturami, můžeme předpokládat molekulární koevoluci mezi hostitelem a jeho patogeny. TLR jsou tudíž díky variabilitě svých ligandů vystaveny značnému selekčnímu tlaku, který může být detekován jak na genetické, tak i proteinové úrovni. I tak je ale míra variability, kterou jsme popsali u ptačích TLR, překvapivě vysoká. Dokonce vyšší, než se dalo očekávat z dříve publikovaných prací u ostatních obratlovců, především savců. Ve své doktorské práci shrnuji výsledky, kterými jsem přispěla k výzkumu TLR u ptáků. Jako první jsme například experimentálně ověřili absenci funkčního TLR5 u několika ptačích druhů, či duplikaci genu pro TLR7 u druhů jiných. Také jsme definitivně rozřešili původ genové duplikace v rodině TLR1 a TLR2. Důležitá část mého výzkumného projektu se týkala predikce potenciálně funkčně významných pozic u...
|
|
|
Charakterizace proteinů dráhy 2'-5' oligoadenylátů pomocí vibrační spektroskopie
Víšová, Ivana ; Kopecký, Vladimír (vedoucí práce) ; Bednárová, Lucie (oponent)
Práce se zabývá strukturní charakterizací dvou významných proteinů dráhy 2'-5' oligoadenylátů, účastnících se imunitní odpovědi organismu na virovou infekci. Studována byla ankyrinová doména myší RNasy L, C-terminální část lidské fosfodiesterázy 12 a následně kompletní lidská fosfodiesteráza 12. Proteiny byly charakterizovány pomocí Ramanovy spektroskopie, infračervené spektroskopie, elektronového cirkulárního dichroismu, dynamického rozptylu světla a jako doplňková měření byla provedena kalorimetrie a gelová elektroforéza. Pro jednotlivé proteiny byla stanovena sekundární struktura, teplotní stabilita, velikost oligomerů a obecně byla provedena jejich základní charakterizace výše zmíněnými metodami.
|
|
|
Studium mechanismu účinku metallakarboranových inhibitorů HIV proteasy
Svoboda, Michal ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent)
Krátce po identifikaci viru HIV jako původce onemocnění AIDS byla v genetické informaci viru objevena sekvence naznačující přítomnost aspartátové proteasy. Proteasa, která byla později u viru skutečně potvrzena, se posléze stala jedním z hlavních terapeutických cílů při boji proti onemocnění AIDS. Zavedení proteasových inhibitorů do antiretrovirové terapie vedlo k výraznému zkvalitnění a prodloužení života virem infikovaných pacientů. Virus, díky své genetické variabilitě, je však schopen se působení inhibitorů poměrně efektivně bránit tvorbou mutantních variant, jež jsou vůči inhibitorům resistentní. Existuje proto stálá potřeba nových inhibitorů, schopných efektivně blokovat i tyto resistentní varianty, a současně zpomalujících vznik nových resistentních variant. Cestou k takovým inhibitorům by mohlo být hledání sloučenin interagujících s enzymem jinde než v jeho aktivním místě, mechanismy nekompetitivní nebo akompetitivní inhibice. Skupinou látek, u nichž byla identifikována schopnost inhibovat HIV proteasu těmito netradičními mechanismy jsou metallakarborany, anorganické sloučeniny bóru, uhlíku, vodíku a iontu přechodného kovu. Pro další optimalizaci těchto inhibitorů je třeba strukturně a biofyzikálně charakterizovat jejich interakci s enzymem. Předkládaná práce je zaměřena na vývoj nástrojů...
|
|
|
Studium konformačního chování krátkých peptidových fragmentů metodami kvantové chemie
Kalvoda, Tadeáš ; Rulíšek, Lubomír (vedoucí práce) ; Vondrášek, Jiří (oponent)
Do jaké míry konformační preference ukrytá v základních stavebních blocích proteinů určuje jejich trojrozměrnou strukturu? Rozsáhlé kvantové-chemické výpočty spojené s moderními solvatačními metodami představují jedinečnou sadu nástrojů k objasnění klíčových faktorů biomolekulární struktury ab initio. Na modelových systémech představujících krátké peptidové fragmenty byl provedeno úplné konformační vzorkování (sampling). Získané výsledky ukazují, jak tyto konformační preference mohou spoluurčovat tvorbu prostorové struktury proteinů. Zároveň poskytují nesmírně cenná data pro nalezení optimálního algoritmu, který účinně dosáhne pokrytí (ideálně všech) nízkoenergetických konformerů delších a delších peptidových fragmentů. Klíčová slova: Konformační prostor, struktura proteinů, peptidy, solvatační metody, Ramachandranův diagram, DFT-D3 metody
|
host ::
RSS.