|
|
Studium minoritních kapsidových proteinů myšího polyomaviru
Vít, Ondřej ; Forstová, Jitka (vedoucí práce) ; Němečková, Šárka (oponent)
Myší polyomavirus (MPyV) je malý neobalený virus. Jeho kapsida se skládá ze 72 pentamerů hlavního kapsidového proteinu VP1. Vnitřní prohlubeň každého pentameru VP1 obsahuje jeden minoritní kapsidový protein, buď VP2 nebo VP3. Minoritní proteiny nejsou potřeba ke vzniku kapsidy, avšak pro infekci hostitelské buňky jsou nezbytné, pravděpodobně kvůli jejich předpokládaným funkcím během vstupu viru do buňky. Po vstupu do buňky jsou viriony MPyV dopraveny do endoplazmatického retikula (ER). Předpokládá se, že VP2 a VP3 jsou zodpovědné za narušení membrány ER, které je potřeba pro následné doručení virové DNA do jádra. V sekvenci VP2 a VP3 byly předpovězeny tři hydrofobní domény. První, v unikátní Nkoncové oblasti VP2, druhá a třetí ve společné části sekvence VP2 a VP3. Třetí doména je zároveň C-koncovým alfa-helixem, zodpovědným za vazbu VP1. V naší laboratoři bylo již dříve zjištěno, že VP2 a VP3 fúzované k N-konci EGFP mají při produkci v savčích buňkách obdobné VP2 a VP3 divokého typu, konkrétně afinitu k vnitrobuněčným membránám a vysokou cytotoxicitu. Aby bylo zjištěno, která z předpokládaných hydrofobních domén VP2 a VP3 je zodpovědná za afinitu k membránám a cytotoxicitu, byly připraveny expresní plazmidy, nesoucí mutované VP2 a VP3 fúzované k N-konci EGFP. Výsledky ukazují, že delece druhé hydrofobní...
|
|
|
Molecular mechanisms and components controlling the Wnt signaling pathway output
Krausová, Michaela ; Kořínek, Vladimír (vedoucí práce) ; Drbal, Karel (oponent) ; Bryja, Vítězslav (oponent)
Souhrn Signální dráha spouštěná proteiny Wnt se významně podílí na kontrole procesů zárodečného vývoje. V dospělém organismu pak tato kaskáda řídí zejména homeostázu tkání. Ve výstelce trávicího traktu udržují fyziologickou hladinu signalizace Wnt různé regulační děje, které zároveň vyvažují protichůdné procesy proliferace, sebeobnovy kmenových buněk či jejich diferenciace do jednotlivých buněčných střevních linií. Bylo jednoznačně prokázáno, že nekontrolovaná aktivace kaskády Wnt vede k vývinu rakoviny trávicího traktu. Předkládaná práce se zaměřuje na popis nových způsobů regulace dráhy Wnt, týkajících se nejen všeobecně platných aspektů přenosu signálu Wnt, ale i kontextově specifických mechanismů. Výsledky jsou předloženy ve třech výzkumných publikacích a dále v jednom přehledovém článku. První článek se věnuje účasti posttranslačních modifikací proteinů Wnt na jejich správném průchodu buněčnou sekreční drahou a také jejich vlivu na následnou signální aktivitu ligandů Wnt. Nejprve byla podrobně studována časová posloupnost a vzájemná provázanost procesů, které jsou spojeny s přídavkem mastných kyselin na postranní řetězce cysteinových a serinových zbytků v myších proteinech Wnt1 a Wnt3a. Tento výzkum se také současně zabýval vazbou cukerných komplexů, které jsou kovalentně připojovány k molekulám...
|
|
|
Role modifikace mastnou kyselinou v aktivitě proteinů
Grobarčíková, Michaela ; Mašín, Jiří (vedoucí práce) ; Petráčková, Denisa (oponent)
Posttranslační modifikace představují kovalentní a obvykle enzymem-zprostředkované úpravy proteinů. Tyto modifikace slouží ke vzniku aktivních forem proteinů a také rozšiřují buněčný repertoár proteinů vzniklých ze standardních aminokyselin. Mezi známé posttranslační úpravy patří například fosforylace, glykosylace, ubikvitinace, proteolýza a také acylace, které se v práci věnuji podrobněji. Acylace proteinů, kovalentní připojení acylové skupiny, je velmi hojnou proteinovou modifikací. Tato reakce je obecně zprostředkována specifickými acyl-transferázami a zahrnuje transport acylové skupiny z donoru na aminokyselinový zbytek. Rozmanité spektrum buněčných proteinů je posttranslačně acylováno a stávají se tím biologicky aktivní. K tomuto jevu dochází u bakteriálních toxinů, jež jsou důležitými faktory virulence patogenních bakterií. Proteinová lipidace reguluje celou řadu biologických drah, jako je cílení do membrán, proteinová sekrece, buněčná signalizace a apoptóza. Posttranslační acylace je též nezbytná pro aktivitu Ras a mnoha dalších proteinů způsobujících rakovinné bujení. Z toho důvodu jsou inhibitory acyltransferáz těchto proteinů testovány jako cíle protinádorových léků. V práci shrnuji poznatky o jednotlivých typech lipidace včetně popisu konkrétních acylovaných proteinů. Klíčová slova...
|
|
|
Role posttranslační modifikace v aktivitě bakteriálních toxinů
Hudáčková, Kristýna ; Mašín, Jiří (vedoucí práce) ; Večerek, Branislav (oponent)
ranslační modifikace proteinů jsou rozšířeným mechanismem, který využívají prokaryotické i eukaryotické buňky pro zvýšení diverzity proteomu. Při posttranslačních modifikacích může docházet k přidávání funkčních skupin, proteinů, proteolytickému štěpení regulačních podjednotek, nebo k degradaci proteinů. Mezi posttranslační modifikace patří například fosforylace, glykosylace, acetylace, modifikace mastnou kyselinou, ubikvitinace či proteolýza. Tyto modifikace mohou ovlivňovat téměř všechny aspekty buněčné biologie či Toxiny produkované mikroorganismy jsou důležitými faktory virulence. Mnoho bakteriálních toxinů využívá posttranslační modifikaci pro svou aktivaci. Do této skupiny patří například listeriolysin O, toxiny bakterie či toxiny klostridií. Velkou skupinou toxinů, které jsou aktivovány modifikací mastnou kyselinou, jsou tzv. RTX toxiny anglického Repeats ních patogenních bakterií, mezi které patří například adenylát cyklázový toxin bakterie , případně α produkovaný uropatogenními bakteriemi
|
|
|
Regulatory mechanisms of WNT signalling
Pospíchalová, Vendula
AB S úspěšno v této si rakovin β signaliz na velm transkrip komplex vstupuje dráhu sp úrovníc P nepublik publikac o poziti studie c buňkách dvou m Hic1 in HIC1, o transkrip střevním zvýšeno V řídící vý BSTRAKT Signální drá ou embryog ignální dráz ny. β-katenin je zace Wnt/β- mi nízké ú pce cílovýc x je degrad e do jádra, pecifickými h regulován Podkladem kovaná dat ce se zaměř ivním vlivu charakterizu h střevního myších kmen vivo. Závěr o interakci p pčního repr m epitelu, c ou citlivost k Věřím, že n ývoj živočic T áha Wnt je genezi, regen ze tudíž ved e hlavním v -katenin). V úrovni neu ch genů pro dační kompl kde vytvář i, a spouští t na celkově a pro předk ta, jež maj řuje na pořa u jaderné b uje protein epitelu exp nů s cílenou rečná kapit polypeptidu resoru HIC1 což má za n k rakovinné naše výsled chů. jednou z h neraci tkání dou ke vznik vnitrobuněč V nestimulov stálou degr oto neprobí lex inaktivo í komplexy tak expresi až stovkou r kládanou di í za cíl lé adí posttrans bílkoviny D TROY jak primujicích u změnou v ola obsahuj u HIC1 se č 1 a v neposl následek ne ému bujení. dky přispěly hlavních ce í a homeost ku vrozený čným prostř vaných buňk radací za íhá. Naopak ován a hladi y s transkrip cílových ge různých fak isertační pr épe porozum slačních úp Dazap2 na h ko nový inh LGR5. Pos v genu Hic1 je...
|
|
|
Kvantifikácia proteínov pomocou hmotnostnej spektrometrie a jej využitie pri sledovaní degeneračných zmien proteínu
Blaženiaková, Karina
Posttranslační modifikace proteinů můžou mít důležitou roli v regulačních dráhách, některé z nich sú však výsledkem stresového působení a stárnutí proteinů. Táto bakalářská práce,Kvantifikace proteinů pomocí hmotnostní spektrometrie a její využití při sledování degeneračních změn proteinů, stručně sumarizuje hlavní posttranslační modifikace související s degeneračními procesy. Experimentální část využívá cílenou analýzu metodou SRM hmotnostní spektrometrie na identifikaci potenciálních míst posttranslačných modifikací. S využitím dostupné lokální spektrální knihovny Hordeum vulgare, byl vybrán vysoko abundantní protein endospermu obilky ječmenu (Serpin-Z4) a optimalizovaná metoda pro cílenou analýzu jeho tryptických peptidů. Celkem bylo sledovaných 14 peptidů reprezentujících víc než 50 % sekvence proteinu. Poškození bylo indukováno inkubací homogenizovaných obilek při teplotě 99 °C po dobu 0,5 - 24 h a též inkubací s peroxidem vodíku s koncentrací 0 - 30 %. Teplotní střes významně snížil zastoupení 7 peptidů a oxidační stres významně snížil zastoupení 4. Mapování těchhle peptidů na 3D strukturu proteinu ukázalo, že většina peptidů s pozměněným zastoupením je pravděpodobně lokalizována na povrchu molekuly a tedy představuje očekávaný cíl stresem vyvolaných modifikací. Nakonec byla vytvořená metoda SRM testována i na extraktech z potravin.
|
|
|
Rostlinný tubulinový kód
Ničová, Klára ; Schwarzerová, Kateřina (vedoucí práce) ; Cvrčková, Fatima (oponent)
Mikrotubuly, které jsou tvořeny polymery α- a β-tubulinu, jsou základní složkou cytoskeletu. Oba typy tubulinů vykazují napříč eukaryotickými organismy značnou sekvenční homologii. Tubuliny jsou kódovány poměrně rozsáhlými genovými rodinami, obzvláště u mnohobuněčných organismů. Expresí těchto genů vznikají tubulinové izotypy, které mohou vykazovat odlišné vlastnosti. Jednotlivé izotypy mohou být dále posttranslačně modifikovány. Mezi nejznámější posttranslační modifikace tubulinu patří acetylace, fosforylace, tyrozinace, polyglutamylace a polyglycylace. Díky kombinaci exprese různých tubulinových izotypů a jejich různých posttranslačních modifikací vzniká v buňkách "směs" heterogenních tubulinů, které mohou vykazovat odlišné vlastnosti a vykonávat různé funkce. Tento jev nazýváme tubulinový kód. Ačkoliv byla existence tubulinového kódu prokázána u většiny modelových organismů včetně rostlin, pochopení přesného významu zabudování různých tubulinu do mikrotubulů je stále předmětem výzkumu. Velká část výzkumu tubulinového kódu byla provedena na živočišných modelech. Oproti tomu v rostlinách se toho o významu tubulinového kódu ví relativně málo. Tato práce shrnuje současné poznatky o výskytu a regulaci tubulinových izotypů a jejich posttranslačních modifikací v rostlinách.
|
|
| |
|
|
Studium ubiquitinace proteinů DELLA
Breineková, Alžběta
Posttranslační modifikace (PTM) proteinů reprezentují fascinující rozšíření dynamické komplexity proteomu živých buněk, ale představují i značnou překážku v analýze proteomu. Identifikace a mapování PTM proteinů se výrazně vylepšily, avšak pro pochopení složitých mechanismů a biologických funkcí je třeba zabývat se také proteiny s velmi nízkou abundancí. V této diplomové práci s názvem Studium ubiquitinace proteinů DELLA byl použit standard rekombinantního proteinu. Je tak poukázáno na možnost jeho využití pro determinaci in vivo modifikovaných peptidů rodiny DELLA proteinu RGA. Pro sekvence peptidů byla navržena SRM analýza pro detekci místa ubiquitinace. Výsledky této analýzy a MS/MS dat poukazují na lokalizaci modifikace v konzervované N-terminální oblasti proteinu RGA.
|
|
|
Vliv posttranslačních modifikací minoritních proteinů a acetylace mikrotubulů na průběh infekce myším polyomavirem
Mariničová, Zuzana ; Horníková, Lenka (vedoucí práce) ; Saláková, Martina (oponent)
Virion myšího polyomaviru (MPyV) je složen z hlavního kapsidového proteinu VP1 a minoritních kapsidových proteinů VP2 a VP3. Minoritní proteiny nejsou nutné pro sestavení kapsidy, jsou ale klíčové pro infektivita virových částic. Tato práce se v první části zabývá modifikacemi VP2 a VP3, deamidací Asn na pozici 253 VP2 (137 VP3) a N-koncovou acetylací Ala VP3, které by mohly být důvodem dvojitých proužků VP2 a VP3 na SDS- PAGE. V minulosti byly připraveny mutantní genomy MPyV N253D (Asn nahrazen Asp) a N253E (Asn nahrazen Glu) simulující deamidaci a A117V (Ala nahrazen Val) se sníženou acetylací. Připravili jsme mutantní viry ve třech izolacích a potvrdili jsme, že deamidace je příčinou dvojitých proužků. Mutantní viry byly porovnány s divokým typem z hlediska efektivity infekce, vliv deamidace se ale nepodařilo prokázat. Virus s mutací A117V je neinfekční, důvodem může být snížení acetylace nebo aminokyselina na této pozici. Dále se tato práce zabývá vlivem acetylace -tubulinu na průběh infekce MPyV. Acetylace - tubulinu je studována z hlediska virové infekce z důvodu vývoje nových antivirových strategií. Po infekci MPyV se acetylace zvyšuje, není to ale důsledek změny exprese mRNA acetylačního (TAT1) nebo deacetylačního enzymu tubulinu (HDAC6). Inhibice HDAC6 pomocí tubacinu, specifického...
|
host ::
RSS.