|
|
Produkce a charakterizace extracelulárních hydroláz z vybraných druhů plísní
Skoumalová, Petra ; Čarnecká, Martina (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
Tato diplomová práce byla zaměřena na studium možností produkce extracelulárních hydrolytických enzymů plísněmi. Teoretická část práce se zaměřuje na charakterizaci vybraných hydrolytických enzymů, jejich katalytické vlastnosti, možnosti produkce extracelulárních hydroláz plísněmi a jejich aplikace. V experimentální části byly enzymy produkovány pomocí plísní Aureobasidium pullulans, Fusarium solani a Phanerochaete chrysosporium při submerzní kultivaci v minerálním médiu obsahujícím navíc složitý odpadní substrát. Jako odpadní substráty byly použity pšeničné, kukuřičné, ovesné a žitné otruby, dřevní piliny, rýže, jablečná vláknina, vaječné a bezvaječné těstoviny. V průběhu kultivace byla sledována produkce celuláz, amyláz, xylanáz, lipáz, proteáz a ligninolytických enzymů (lakáza, Mn-dependentní peroxidáza, lignin peroxidáza). Produkce enzymů se lišila v závislosti na použitém substrátu i čase kultivace U celuláz, xylanáz a amyláz byla nejvyšší produkce naměřena na začátku kultivace (3. až 7. den). Proteázy a ligninolytické enzymy byly produkovány hlavně v závěru kultivace (7. až 10. den). Lipolytická aktivita byla detekována pouze u A.pullulans, přičemž její hodnota rostla s délkou kultivace a nejvyšší hodnota byla stanovena při kultivaci na pšeničných otrubách (3,6 nmol/ml.min). Nejvyšší xylanázová a celulázová aktivita (170,3 nmol/ml.min, 248,0 nmol/ml.min) byla stanovena při kultivaci plísně F. solani na kukuřičných otrubách. Nejvyšší amylázou aktivitu (111,8 nmol/ml.min) vykazovala plíseň P. chrysosporium při kultivaci na rýži. Nejvyšší aktivita proteázy (68,0 nmol/ml.min) byla naměřena při kultivaci plísně F. solani na pšeničných otrubách. Nejlepším producentem lakázy byl kmen A.pullulans, nejvyšší produkce byla zaznamenána na bezvaječných těstovinách (27,0 nmol/ml.min). Nejvyšší aktivita ligninperoxidázy (12,5 nmol/ml.min) byla naměřena u F.solani na vaječných těstovinách, nejvyšší produkce Mn-dependentní peroxidázy (7,7 nmol/ml.min) bylo dosaženo při kultivaci A.pullulans na pšeničných otrubách. Ligninolytické enzymy se chovaly jako induktivní. U ostatních enzymů byla jejich produkce zaznamenána i na minerálním mediu, u A. pullulans byla aktivita celuláz na minerálním médiu dokonce vyšší než u ostatních použitých substrátů. U preparátu získaného z média A. pullulans byla také provedena purifikace produkovaných enzymů pomocí ultrafiltrace, ionexové chromatografie a gelové filtrace.
|
|
|
Biodegradace azobarviv působením hub bílé hniloby
Bírošíková, Paulína
Houby bílé hniloby, které patří mezi dřevokazné houby, mají schopnost rozkládat složité aromatické struktury, jako je lignin, po případě polutanty s aromatickou strukturou (tetracykliny, endokrinní disruptory) prostřednictvím extracelulárních ligninolytických enzymů. Azobarviva jsou syntetická barviva obsahující aromatické kruhy s vázanými substituenty spojenými azoskupinou. Houby jsou schopny tyto struktury degradovat, přičemž dochází ke ztrátě barviva, tzv. dekolorizaci. Cílem této bakalářské práce je prozkoumat schopnost degradace tří typů azobarviv (methylenové červeně, tartrazinu a azorubinu) deseti druhy hub bílé hniloby. Kultivace jednotlivých hub s barvivy byla prováděna po dobu dvaceti čtyř dnů, během nichž byla v intervalech každého druhého pracovního dne sledována absorbance na UV/VIS spektrofotometru. Z naměřených hodnot byla vypočtena ztráta barvy a hodnoty dechlorace byly vyjádřeny graficky v procentech. Vybrané houby vykazovaly nejvyšší dekolorizaci tartrazinu druhý den pokusu, a to v průměru 89 %, s výjimkou houby Fomes fomentarius, u níž dekolorizace barviva nebyla pozorována. Naopak nejméně degradovaným barvivem byl azorubin, a to v průměru 37 % na konci pokusu u většiny druhů hub. Nejstabilnější průběh dekolorizace vykazovala methylenová červeň, jejíž průměrná hodnota na konci měření činila 77 %. Účinek dekolorizace byl ovlivněn strukturou azobarviv a účinností konkrétních druhů hub.
|
|
|
Studium biodegradace PCB pomocí ligninolytických hub.
Kožená, Lenka ; Bosáková, Zuzana (vedoucí práce) ; Olšovská, Jana (oponent)
Byla sledována schopnost biodegradace komerční směsi Deloru 103 pomocí osmi druhů ligninolitických hub ve dvou typech živných médií: v dusíkem limitovaném minerálním médiu tzv. Kirkovo médium a v komplexním Malt-extrakt glukosovém médiu. Nejúčinnější biodegradace byla prokázána u kmene Pleurotus ostreatus, kde byla pozorována 99% biodegradace sumy kongenerů PCB po 42 dnech v obouch médiích. U houby Bjerkandera adusta v kompexním médiu byla schopnost biodegradace 89% sumy kongenerů PCB během 42 dní. U houby Irpex lacteus v Kirkově médiu byla schopnost biodegradace 70% sumy kongenerů PCB během 42 dní. U ostatních studovaných ligninolytických hub byla prokázana nižší schopnost biodegradace, zejména pak byly degradovány nízkochlorované bifenyly. Dále byla sledována akutní toxicita v průběhu biodegradace Deloru 103. Nejvhodnější pro dekontaminaci PCB je P. ostreatus, neboť v průběhu biodegradace PCB bylo pozorováno snížení toxicity ve srovnání s kontrolou. U ostatních hub nebylo pozorováno snížení akutní toxicity. Také byla studována aktivita ligninolytických enzymů při biodegradaci PCB. V obou typech médií byla detekována enzymová aktivita lakasy v kulturách Dichomitus squalens, Pycnoporus cinnabarinus a Trametes versicolor; enzymová aktivita ligninperoxidasy v kulturách Pycnoporus cinnabarinus;...
|
|
|
Aktivity enzymů podílejících se na transformaci polycyklických aromatických uhlovodíků v průběhu kompostování
Šírová, Kateřina ; Cajthaml, Tomáš (vedoucí práce) ; Dračínská, Helena (oponent)
Polycyklické aromatické uhlovodíky (PAU) jsou rekalcitrantní organické polutanty široce rozšířené v životním prostředí. Některé PAU mají karcinogenní účinky a mohou být i jinak toxické, proto je věnována značná pozornost výzkumu vhodných bioremediačních technologií. Jednou ze slibných metod použitelných pro bioremediaci pevných materiálů kontaminovaných PAU je kompostování. V rámci této práce byly studovány změny vybraných enzymových aktivit během kompostování půdy kontaminované PAU (součet koncentrací všech analyzovaných PAU 1065 ± 86 µg·g-1 ). Stanovované aktivity reprezentovaly známé klíčové enzymy transformace PAU nebo katecholu jakožto ústředního metabolitu mikrobiální degradace PAU. Nejprve byla optimalizována metoda extrakce enzymů z kompostovaného materiálu. Tento postup byl poté použit k extrakci enzymů ze vzorků kompostu odebraných v jednotlivých teplotních fázích kompostování. V počáteční mesofilní fázi byla detekována pouze aktivita mangan-dependentní peroxidasy, zatímco během chladnutí a na počátku maturace byla kromě toho detekována i aktivita lakasy, tyrosinasy a katechol-2,3-dioxygenasy. Aktivita katechol-1,2-dioxygenasy a ligninperoxidasy nebyla zaznamenána při žádném odběru. Vzhledem ke srovnání s kontrolním kompostem, který neobsahoval kontaminovanou půdu, nebyl pozorován žádný...
|
|
|
Imobilizácia lignolytických enzýmov
Schlosserová, Nikola
Ligninolytické systémy našly své využití v potravinářském průmyslu ale využívají se také k degradaci různých cizorodých sloučenin a barviv. Tato vlastnost z nich činí užitečný nástroj pro bioremediačné ůčely a proto se zájem o ligninolytické enzymy zvyšuje. Tato práce se zabývá přípravou imobilizovovaného enzymu lignin peroxidázy metodou CLEA z hub Piptoporus betulinus, Trametes gibbosa a jejich společné kokultivácie. Byly srovnávany aktivity volných i imobilizovaných enzymů z těchto hub měřené pomocí UV/VIS spektrometru a byly stanoveny optimální podmínky precipitace a imobilizace metodou CLEA. Optimální pH precipitace proteinů bylo pro Piptoporus betulinus pH 7,0 pro Trametes gibbosa pH 5,0 a pro kokultiváci pH 6,0. Nejlepší koncentraci glutaraldehydu byla pro Piptoporus betulinus a kokultiváci 50 mM a pro Trametes gibbosa 10 mM. Imobilizaci se podařilo u všech enzymů zvýšit aktivitu o více než 20 %. Po optimalizaci přípravy CLEA enzymů se testovaly parametry jako je optimální pH, stabilita, teplotní optimum a stabilita. Všechny enzymy měli své pH optimum v kyselém až mírně kyselém prostředí a teplotní optimum se pohybovalo v rozmezí od 30 ℃ do 40 ℃. Imobilizovaný CLEA enzym z kokultivace byl ze všech nejstabilnější. Pro ověření aplikačního potenciálu se volné a CLEA enzymy testovali na třech potravinářských barvivech kde byla zkoumána jejich biodegradační schopnost. ůbytek barviva byl měřen pomocí HPLC s DAD detektorem. Významnou roli v tomto experimentu hrála sorpce houbami, které si v barvivech vytvořili mycelia a barvivo částečně nasály a proto u volných enzymů došlo k většímu úbytku barviva jako při jejich CLEA enzymech. Nejlepší schopnost dekolorizácie vykazoval volný enzym z houby Trametes gibbosa, který po 14. dnech kultivace odbarvil barvivo o více než 90 %. Celkově enzymy nejlépe odbarvovaly barvivo azorubin, protože všechny volné enzymy odbarvily toto barvivo po 14. dnech o více než 80%. CLEA enzymům se nepodařilo degradovat barviva v takové míře, což by mohlo být způsobeno tím, že se enzymy v barvivech nekultivovali se svým substrátem (veratrylalkoholom). Mnoho výzkumů se zabývá metodami jako zvyšovat aktivitu a produkci ligninolytických enzymů a výsledky v práci naznačují, že kokultivací by bylo možné zvýšit Lip aktivitu a imobilizaci vytvořit enzym se zlepšenými vlastnostmi.
|
|
|
Využití hub bílé hniloby při bioremediaci polutantů
Nedvědická, Žaneta
Farmaceuticky aktivní látky jsou významnou skupinou polutantů a kvůli jejich všudypřítomnosti v životním prostředí a obtížné degradaci vzrostl zájem vědecké komunity o tuto problematiku. Alternativní možností k dosavadním postupům degradace těchto látek je působení hub bílé hniloby, a to díky jejich účinnému nespecifickému enzymatickému systému. Praktická část práce byla zaměřena na prokázání schopnosti biodegradace za pomoci šesti kmenů hub bílé hniloby Phellinus rhamni, Schizophyllum communae, Phellinus robustus, Ganoderma resinaceum, Phanerochaete chrysosporium a Trametes versicolor. Na základě screeningu založeného na posouzení růstového potenciálu a degradačních schopností z uvedených zástupců hub byl vybrán kmen Trametes versicolor. Tento kmen byl v experimentální části použit pro biodegradaci vybraných farmaceuticky aktivních látek, a to ve formě nejpoužívanějších nesteroidních, protizánětlivých, volně dostupných léčiv aspirinu a paralenu. Během provedených experimentů byl v čase spektrofotometricky sledován úbytek koncentrací léčiv a aktivita lakasy jakožto zástupce ligninolytických enzymů podílejících se na degradaci farmaceuticky aktivních látek, a to v živném médiu při kultivaci s Trametes versicolor. Během několikadenních experimentů byla houba schopna rozložit obě studovaná léčiva, což bylo prokázáno jejich 100% degradací v médiu. Úbytek koncentrací léčiv byl doprovázen zvyšováním lakasové aktivity. Výsledky prokázaly, že za testovaných experimentálních podmínek byla lakasa aktivním extracelulárním enzymem a biosorpce, pravděpodobně i intracelulární enzymy také přispívaly k odstranění farmaceuticky aktivních látek. Na základě naměřených dat z provedených experimentů se Trametes versicolor řadí mezi vhodné kandidáty pro dekontaminaci v praxi a mohla by být uplatněna například při snižování ekotoxikologického dopadu polutantů přítomných v odpadních vodách, v potravinářském, textilním, kosmetickém i farmaceutickém průmyslu.
|
|
|
Using of modern molecular methods for isolation and identification of ligninolytic enzymes
Řiháček, Martin
Ligninolytické enzymy jsou schopné degradovat strukturu ligninu. Tohoto efektu se dá využít v různých průmyslech (potravinářský průmysl, textilní průmysl, zemědělství atd.), protože to může nahradit obvyklé chemické procesy. Houba bílé hniloby Phanerochaete chryosporium je známa produkcí těchto enzymů. Bakalářská práce pojednává o identifikaci a charakterizaci chování enzymů lignin peroxidázy, lakázy, mangan peroxidázy produkované touto houbou rostoucí v kapalném médiu při různých koncentracích síranu měďnatého (0, 0.1, 0.5 a 1 mM). Pro izolaci DNA a RNA bylo použito kapalné medium PDB, ve kterém houba rostla po dobu 5 dnů. Pro experimentálcí část byla použita běžná polymerázová řetězová reakce (PCR), reverzně transkripční PCR a kvantitativní rea-time PCR. Amplifikované produkty po běžné PCR byly očištěny a odeslány na sekvenování, aby se potvrdilo, jak se různé isoformy těchto enzymů vyvíjí při stresových podmínkách způsobené přídavkem síranu měďnatého o různých koncentracích. Navíc byla ještě měřena enzymatická aktivita těchto enzymů po dobu 32 dnů. 1 mM koncentrace síranu měďnatého v kapalném médiu ovlivnila transkripci genů, kódující ligninolytické enzymy, produkcí jejich isoforem. Kromě toho, byla při této koncentraci také pozorována vyšší genová exprese těchto 3 genů: lakáza, mangan peroxidáza a lignin peroxidáza při srovnání s kontrolními vzorky. Na druhou stranu, nejlepší podmínky pro produkci těchto enzymů byly pozorovány pro lignin peroxidázu a mangan peroidázu při koncentraci 0.5 mM a pro lakázu 1 mM CuSO4. Proto jsme schopni říct, že produkce těchto enzymů houbou Phanerochaete chrysosporium je ovlivněna vysokou koncentrací měďnatých iontů.
|
|
|
Využití ligninolytických enzymů v potravinářství
Nadtochaeva, Polina
Ligninolytické enzymy jsou enzymy produkované dřevokaznými houbami a díky své vysoké reakční aktivitě a nízké specifitě se v poslední době staly důležitými enzymy pro biotechnologické využití. Tato práce stručně popisuje nejdůležitější ligninolytické enzymy a jejich reakční mechanismy a shrnuje způsoby využití těchto enzymů v potravinářském průmyslu. Velká pozornost je věnována biosenzorům, které se využívají jako moderní analytické nástroje pro detekci fenolických sloučenin. V praktické části byla vyzkoušena příprava vlastního biosenzoru pro detekci a stanovení koncentrace (+) katechinu. Měření bylo provedeno metodou diferenční pulsní voltametrie pomocí uhlíkové pastové elektrody, která byla připravena s použitím imobilizované lakázy z ligninolytické houby Trametes versicolor. Bylo provedeno měření standardních roztoků, které prokázalo, že takto připravený biosenzor dokáže detekovat i poměrně malá množství katechinu. Daný biosenzor byl následně použit na reálné vzorky červeného vína a zelených čajů. Byl změřen obsah katechinu ve čtyřech vzorcích čaje. Koncentrace byly přibližně stejné a pohybovaly se v rozmezí 19,57 – 24,91 mg·l-1. V případě vína se zjistilo, že vzhledem ke komplikované matrici je sice kvantitativní analýza možná, nicméně vyžaduje vhodné matematické zpracování výsledků nebo předběžnou úpravu vzorku.
|
|
|
Degradace syntetických barviv pomocí Phanerochaete chrysosporium
Blahutová, Andrea
Azobarviva jsou nejvýznamnější a největší skupina komerčně produkovaných syntetických barviv. Jejich degradace pomocí houby bílé hniloby Phanerochaete chrysosporium je realizována díky účinnému ligninolytickému enzymovému systému, který je schopen podílet se na degradaci xenobiotických sloučenin. Tato bakalářská práce je zaměřena na studium degradace pěti komerčně nejpoužívanějších potravinářských azobarviv pomocí Phanerochaete chrysosporium. Degradace byla sledována nejen u samostatných barviv (E102 Tartrazin, E110 Žluť SY, E122 Azorubin, E124 Ponceau 4R a E123 Amarant), ale také u dvou potravinářských produktů (Vitacit - citrón a Vitacit - jahoda), obsahujících azobarvivo E102 Tartrazin a E122 Azorubin. Během dvacetidenní kultivace byla, ve čtyřdenních intervalech, spektrofotometricky měřena absorbance jednotlivých roztoků a na základě zaznamenaných hodnot byl vypočítán úbytek barvy. Výsledky byly vyjádřeny jako procento dekolorizace. Nejvyšší dekolorizaci (90 %) vykazovalo na konci měření barvivo Azorubin, naopak barvivo Ponceau 4R bylo odbarveno nejméně (20 %). Stupeň dekolorizace roztoků práškových nápojů byl srovnán s dekolorizací samostatných barviv v nich obsažených. Degradace byla ovlivněna především rozdílnou strukturou azobarviv. V případě práškových nápojů pak také hrálo roli jejich složení.
|
|
|
Bioremediation of persistent aromatic pollutants
Stella, Tatiana ; Cajthaml, Tomáš (vedoucí práce) ; Mihaljevič, Martin (oponent) ; Tesařová, Eva (oponent)
Remediace persistentních chlorovaných aromatických sloučenin se stala prioritou vzhledem k teratogenním, karcinogenním a endokrinním účinkům těchto xenobiotik. V současné době si získává při sanacích znečištěných lokalit stále větší pozornost použití biologických remediačních technologií, souhrnně označovaných jako bioremediace. Představují efektivní, cenově konkurenceschopnou alternativu šetrnou k životnímu prostředí ve srovnání s fyzikálně-chemickými dekontaminačními postupy. Jako vhodný kandidát pro vytvoření remediační technologie se jeví skupina ligninolytických basidiomycetních hub tzv. houby bílé hniloby (mykoremediace). Doposud však nebyly pro své metabolické schopnosti široce využívány a mechanismus, jakým jsou schopny degradovat výše zmíněné polutanty, není rovněž plně prozkoumán. Tato disertační práce byla zaměřena na: i) zhodnocení účinnosti různých mykoremediačních strategií při odstraňování polychlorovaných bifenylů (PCB) z kontaminované půdy, ii) porozumění mechanismu specifických houbových degradačních drah PCB a jejich hlavních metabolitů (CBA, chlorbenzoové kyseliny a OH-PCB, hydroxylované polychlorované bifenyly). i) K vyhodnocení technické proveditelnosti vybraných remediačních strategií byla použita kombinace chemických, toxikologických a molekulárně-biologických technologií....
|
host ::
RSS.