|
|
Phosphoinositides and their effectors in regulation of the Wnt signalling pathway
Knop, Filip ; Macůrková, Marie (vedoucí práce) ; Krausová, Michaela (oponent)
Fosfoinositidy představují pouze malou část celkového množství lipidů v buněčných membránách. Přesto je jejich činnost zprostředkovaná proteinovými efektory nezbytná pro buněčnou signalizaci, vezikulární transport, pohyb buňky a jiné důležité procesy v životě buňky. Tato bakalářská práce popisuje funkci fosfoinositidů ve Wnt signální dráze. Při Wnt signalizaci je mnoho momentů kdy je nezbytná spolupráce s fosfoinositidy. Retrográdní transport Wntless molekuly (Wls) z plazmatické membrány zpět do Golgiho aparátu nebo internalizace Wnt receptorů v buňkách citlivých vůči Wnt signalizaci jsou pouze dva příklady. Oba procesy jsou přísně regulovány a poruchy funkce enzymů zpracovávajících fosfoinositidy může způsobit deregulaci těchto procesů, eventuálně deregulaci Wnt signální dráhy. Jelikož je deregulace Wnt signální dráhy známá příčina vážných nemocí včetně rakoviny, pochopení interakcí mezi fosfoinositidy a Wnt signalizací může pomoci vývoji nových strategií v léčbě těchto chorob.
|
|
|
Hlavní strukturní protein myšího polyomaviru: interakce s buněčnými strukturami
Horníková, Lenka
Myší polyomavirus (MPyV) je malý neobalený DNA virus. I když je tento virus zkoumán již více než 50 let, stále zůstává nezodpovězená otázka, jak virus dopraví svou genetickou informaci do jádra nebo jakým mechanismem jsou sestavovány viriony v infikovaných buňkách. V první části práce jsme se zaměřili na charakterizaci endocytické dráhy, kterou využívá myší polyomavirus k dopravě genetické informace do blízkosti jádra. Pomocí dominantně negativní mutanty kaveolinu 1 jsme ukázali, že internalizace a efektivní infekce MPyV není závislá na kaveolinu 1. MPyV při vstupu do buňky využívá časné endozomy. Pro produktivní infekci je nezbytné kyselé pH endozomů. Zabránění vstupu viru do časného endozomu (dominantně negativní mutanta GTPázy Rab 5) nebo zvýšení pH endozomů (chloridem amonným nebo bafilomycinem A1) vedla k drastickému snížení infektivity MPyV. Alkalizace endozomů měla za následek zadržování virionů v časných endozomech, což naznačuje, že virus je dále transportován do pozdního endozomu. Pomocí metody FRET jsme potvrdili, že MPyV je v perinukleárním prostoru lokalizován v recyklujících endozomech. Dalším, dosud málo charakterizovaným dějem životního cyklu MPyV je morfogeneze virionu. Jaderné a celobuněčné lyzáty infikovaných buněk nebo buněk transientně produkujících hlavní kapsidový protein MPyV, VP1,...
|
|
|
Dynamika plasmatické membrány a tonoplastu při zavírání a otevírání průduchů.
Röder, Matěj ; Žárský, Viktor (vedoucí práce) ; Albrechtová, Jana (oponent)
Průduchy jsou struktury v pokožce rostlin zajišťující svou průduchovou štěrbinou regulovaný kontakt apoplastického prostoru rostliny s okolím. Zásadní úlohu pro zahájení otevření či zavření průduchu hraje změna turgoru ve svěracích buňkách. Během stomatálních pohybů prodělává svěrací buňka značné a opakované změny svého objemu, a tedy i povrchu, v rámci minut. Protože cytoplazmatická membrána má pouze malou roztažitelnost, tak tato změna musí být doprovázena i změnou povrchu membrány. Ta se může dít pomocí membránových vchlípenin a endocytózy membránových váčků. Pomocí elektrofyziologických a mikroskopických technik bylo dokázáno, že oba procesy se ve svěracích buňkách reálně dějí. Tyto procesy jsou ovládány a regulovány komplexní sítí signálních drah, v nichž důležitou roli hraje aktinový i mikrotubulární cytoskelet, proteiny z nadrodiny SNARE, iontové kanály a další molekuly. Cílem této práce je sumarizovat současné znalosti o procesech a mechanismech těchto změn membránových povrchů a jejich molekulovou podstatu.
|
|
|
Hlavní strukturní protein myšího polyomaviru: interakce s buněčnými strukturami
Horníková, Lenka ; Forstová, Jitka (vedoucí práce) ; Němečková, Šárka (oponent) ; Mělková, Zora (oponent)
Myší polyomavirus (MPyV) je malý neobalený DNA virus. I když je tento virus zkoumán již více než 50 let, stále zůstává nezodpovězená otázka, jak virus dopraví svou genetickou informaci do jádra nebo jakým mechanismem jsou sestavovány viriony v infikovaných buňkách. V první části práce jsme se zaměřili na charakterizaci endocytické dráhy, kterou využívá myší polyomavirus k dopravě genetické informace do blízkosti jádra. Pomocí dominantně negativní mutanty kaveolinu 1 jsme ukázali, že internalizace a efektivní infekce MPyV není závislá na kaveolinu 1. MPyV při vstupu do buňky využívá časné endozomy. Pro produktivní infekci je nezbytné kyselé pH endozomů. Zabránění vstupu viru do časného endozomu (dominantně negativní mutanta GTPázy Rab 5) nebo zvýšení pH endozomů (chloridem amonným nebo bafilomycinem A1) vedla k drastickému snížení infektivity MPyV. Alkalizace endozomů měla za následek zadržování virionů v časných endozomech, což naznačuje, že virus je dále transportován do pozdního endozomu. Pomocí metody FRET jsme potvrdili, že MPyV je v perinukleárním prostoru lokalizován v recyklujících endozomech. Dalším, dosud málo charakterizovaným dějem životního cyklu MPyV je morfogeneze virionu. Jaderné a celobuněčné lyzáty infikovaných buněk nebo buněk transientně produkujících hlavní kapsidový protein MPyV, VP1,...
|
|
|
Adenylátcyklázový toxin Bordetella pertussis jako marker pro studium endocytózy komplementového receptoru CD11b/CD18.
Chvojková, Věra ; Bumba, Ladislav (vedoucí práce) ; Černý, Jan (oponent)
Bordetella pertussis způsobuje u lidí infekční onemocnění nazývané černý kašel. Tato gram-negativní bakterie produkuje adenylátcyklázový toxin (CyaA), který se váže na integrinový receptor CD11b/CD18 na povrchu myeloidních fagocytů a dopravuje do jejich cytosolu adenylátcyklázovou doménu (AC). Tato práce se zabývá studiem endocytózy CyaA a jeho využití jako specifické značky při studiu endocytické dráhy CD11b/CD18 receptoru. Detoxifikovaná verze toxinu, CyaA-AC- , jenž je schopna zvyšovat intracelulární koncentraci vápenatých iontů a zároveň umožňuje únik draselných iontů z buňky, způsobuje aktivaci integrinového receptoru CD11b/CD18, což vede k následné endocytóze prostřednictvím dráhy závislé na klatrinu. Na druhou stranu, inaktivní mutanta CyaA-KP-AC- nespouští aktivaci receptoru a je endocytována prostřednictvím jiné dráhy, která je na klatrinu nezávislá. Tyto data naznačují, že mechanismus endocytózy CD11b/CD18 je určován a regulován odlišnými konformačními stavy tohoto receptoru.
|
|
|
Úloha endocytózy a endosomální acidifikace v apoptóze indukované ligandem TRAIL
Hradilová, Naďa ; Anděra, Ladislav (vedoucí práce) ; Kovář, Jan (oponent)
Pro úspěšný přenos apoptotického signálu je nezbytné efektivní formování multimerního komplexu DISC (death-inducing signaling complex) a následná aktivace iniciační kaspázy-8. Avšak počáteční děje vedoucí plné aktivaci kaspáz nejsou zcela objasněny. Jedním z faktorů, které mohou iniciaci vnější receptorové dráhy ovlivnit, je endocytóza komplexu TRAILDR4/ 5-DISC (tzv. receptozom). Recentní studie zabývající se úlohou endocytózy TRAILového receptozomu podávají rozporuplné výsledky. U různých buněčných linií byl pozorován proapoptotický, antiapoptotický nebo dokonce žádný vliv endocytózy receptozomu. V této práci jsme se zaměřili na určení úlohy endocytózy a následné acidifikace TRAIL receptozomů během TRAILem indukované apoptózy u buněčných linií odvozených od kolorektálního karcinomu. Prokázali jsme se, že na klatrinu závislá endocytóza TRAILových receptozomů a zároveň i endozomální a lyzozomální acidifikace je potřebná pro efektivní aktivaci kaspázy-8 a kaspázy-3 během časné fáze apoptózy. Inhibice endocytózy a acidifikace vedly k poklesu apoptotické signalizace během první hodiny od indukce apoptózy. Tento inhibiční efekt byl pouze přechodný a nedošlo k úplnému zastavení apoptotické signalizace. Inhibice acidifikace pomocí inhibitorů V-ATPázy způsobila také celkové zpomalení apoptotických dějů a změny v...
|
|
|
The role of CUP-4 protein in Wnt signalling
Žídek, Radim ; Macůrková, Marie (vedoucí práce) ; Pospíchalová, Vendula (oponent)
Wnt signalizace je nezbytná pro správný vývoj organismů a zachování homeostáze v dospělosti. Její narušení je častou příčinou onemocnění. U háďátka Caenorhabditis elegans řídí Wnt signalizace celou paletu vývojových procesů, mezi něž patří také migrace Q neuroblastů a jejich dceřinných buněk. Jediný Wnt, který se podílí na tomto procesu, EGL-20, spouští kanonickou dráhu přenosu Wnt signálu přes β-katenin v QL, ale nikoliv v QR neuroblastu, což vede k tomu, že QL zůstane v zadní části těla, zatímco QR migruje anteriorně. Tato migrace představuje užitečný nástroj pro studium Wnt signalizace. Nedávno bylo zjištěno, že také mutace genu cup-4 způsobuje poruchu migrace QL neuroblastu u malé části mutantní populace. cup-4 kóduje protein z rodiny ligandem ovládaných iontových kanálů, který se podílí na endocytóze v coelomocytech, specializovaných fagocytických buňkách v tělní dutině C. elegans. V této práci uvádím výsledky mé snahy o umístění CUP-4 do Wnt signalizace a objasnění mechanismu jeho fungování. Zjistil jsem, že CUP-4 je v signální dráze zapotřebí dříve než PRY-1/Axin, který se účastní přenosu signálu v cílových buňkách, a pravděpodobně později než adaptin AP2, který je důležitý pro opětovné využití proteinu Wntless (Wls), receptoru sloužícího k dopravě Wnt proteinu ve Wnt produkujících buňkách....
|
|
|
Úloha endocytózy v signální dráze proteinu Wnt
Matějů, Daniel ; Libusová, Lenka (vedoucí práce) ; Doubravská, Lenka (oponent)
Endocytóza a mezibuněčná signalizace jsou úzce propojené procesy. To je nejpatrnější na úrovni endocytózy receptorů a ligandů signálních drah. Dlouhou dobu byla endocytóza signálních receptorů považována za mechanismus negativní zpětné vazby, kterým se po stimulaci ligandem snižuje citlivost buňky k signálu. Dnes je však patrné, že tento proces je komplexnější a endocytóza může ovlivňovat signalizaci jak negativně tak i pozitivně. V této práci se budu zabývat tím, jaký vliv má endocytóza receptorů a ligandů Wnt signalizace na tuto signální dráhu. Wnt signalizace je jednou z nejvýznamnějších a nejstudovanějších signálních drah figurujících ve vývoji živočichů. V poslední době bylo objeveno několik mechanismů, kterými endocytóza ovlivňuje Wnt signalizaci, přičemž některé z nich jsou v rámci ostatních signálních drah unikátní. Pochopení vztahů mezi endocytózou a Wnt signalizací tak přispěje nejen k hlubšímu porozumnění Wnt signalizace, ale také toho, jak mohou buňky využívat endocytózu a vezikulární transport pro regulaci mezibuněčné signalizace obecně.
|
|
|
Fluorescenční studie bakteriálních membránových proteinů a buněčné signalizace.
Fišer, Radovan ; Konopásek, Ivo (vedoucí práce) ; Hof, Martin (oponent) ; Forstová, Jitka (oponent)
(česky) Tato práce shrnuje pět publikací, které se zabývají převážně adenylátcyklázovým toxinem (CyaA) bakterie Bordetella pertussis a jeho interakcí s biologickou membránou. CyaA narušuje buněčné membrány tvorbou malých kationtselektivních kanálů a rozvrací buněčnou signalizaci pomocí enzymu (AC, adenylátcyklázy) přeměňujícího buněčné ATP na cAMP. První studie objasňuje mechanizmus narušování membrány v případě CyaA a příbuzného RTX toxinu, αhemolyzinu (HlyA) produkovaného Escherichia coli. K tomuto účelu byly použity lipozómy jako umělý membránový systém a fluorescenční zhášecí metoda. Oba zkoumané toxiny vykazovaly postupný únik materiálu z lipozómů a rozdílné iontové selektivity (Fišer a Konopásek 2009). Jak doprava AC domény, tak tvorba kanálů jsou závislé na vlastnostech predikovaného transmembránového αhelixu (502522). V naší práci jsme zkoumali další predikovaný transmembránový segment (565591), který nese kyselé zbytky Glu(570) a Glu(581). Většina pokusů byla prováděna na erytrocytech a planárních lipidových membránách. Zjistili jsme, že záporný náboj v pozici 570 je zásadní pro iontovou selektivitu kanálu a je patrně umístěn v blízkosti jeho ústí. Substituce v obou pozicích zásadně ovlivňují schopnost translokace AC domény...
|
|
|
Functional analysis of syntaxin 16 phosphorylation using yeast as a model
Volfová, Barbora ; Entlicher, Gustav (vedoucí práce) ; Dráber, Petr (oponent)
3 Abstrakt Mechanismus fúze intracelulárních membrán v eukaryotických buňkách zahrnuje několik skupin proteinů, včetně rodiny receptorů pro záchytný protein rozpusného N-ethylmaleinimid-senzitivního-faktoru (SNARE) a Sec1/Munc-18 příbuzných proteinů (SM proteinů). Je známo, že transport v buňkách je evolučně konzervovaný od kvasinek po člověka. Proto pro usnadnění výzkumu, můžeme použít jednoduché eukaryotní buňky Saccharomyces cerevisiae. Savčí SNARE protein syntaxin 16 má známý funkční kvasinkový homolog, protein Tlg2p, který byl použit v této studii jako model pro studium vlivu fosforylace na funkci syntaxinu 16. Také jejich vazebné partnery, SM proteiny mVps45p (savčí) a kvasinkový Vps45p, jsou homologní. Fosforylace SNARE proteinů je známá jako možný způsob regulace fúze membrán. Odstranění jednoho z možných fosforylačních míst na Tlg2p - serinu 90 významně ovlivňuje exocytické a endocytické pochody. Práce prezentovaná v této studii ukazuje některé fenotypy mutant založených na tomto fosforylačním místě proteinu Tlg2p. Těmi mutantami jsou S90A (nefosforylovatelná - mutace serinu na alanin) a S90D (fosfomimetická - mutace serinu na asparagovou kyselinu - kyselá karboxylová skupina napodobuje fosfátovou skupinu). Bylo zjištěno, že fosforylace proteinu Tlg2p na serinu 90 neboli mutace Tlg2p- S90D může...
|
host ::
RSS.